آزواسپرمی- ناباروری مردان (AZF)

عامل اصلی ناباروری در مردان چیست؟

امروزه ناباروری به عنوان یکی از مشکلات حائز اهمیت در بین زوجین مطرح می شود که حدود 10 تا 15 درصد از افراد متاهل دنیا را تحت تاثیر خود قرار داده است. ناباروری را می توان به عنوان ناتوانی در باردار شدن پس از یک سال رابطه جنسی محافظت نشده تعریف کرد. در میان علل مرتبط با ناباروری زوجین، تقریبا 50% موارد مرتبط با مردان و ناباروری به دلیل AZF می باشد. در این میان، عوامل ژنتیکی نقش های کلیدی در ناباروری مردان ایفا کرده و تغییرات ژنتیکی کروموزوم Y از اهمیت ویژه ای برخوردار است.

عوامل ژنتیکی اصلی در زمینه ناباروری مردان، شامل ناهنجاری های کروموزومی (فاکتور AZF) و ریزحذف های کروموزومی Y (Y chromosomal microdeletions) یا به اختصار YCMs است. این دسته از مشکلات ژنتیکی تقریباً در 10 تا 15 درصد از بیماران آزواسپرمی و 5 تا 10 درصد از بیماران الیگواسپرمی شدید مشاهده شده و معمولاً در محل فاکتور آزواسپرمی یا فاکتور AZF در با موقعیت کروموزومی q11.23 یافت می گردند. آنالیز ‌ها و بررسی مولکولی AZF، لوکوس AZF را به subregions های زیر تقسیم می ‌کند که عبارتند از:

AZFa
AZFb
AZFc

کروموزوم Y پستانداران، یک کروموزوم آکروسنتریک می باشد که از دو ناحیه شبه اتوزومی (PARs) و یک بازوی کوتاه (Yp) و یک بازوی بلند (Yq) تشکیل شده است. این دو بازو توسط یک سانترومر از هم جدا شده اند. نواحی PAR1 و PAR1 در کروموزوم Y دارای همولوژی با کروموزوم X هستند که این امر در طول تقسیم میوز و جفت شدن کروموزوم ها از اهمیت بالایی برخوردار است. نتایج مطالعات مختلف نشان می دهند که بروز برخی جهش های حذفی در بازوی بلند کروموزوم Y می تواند با نقص در تولید اسپرم مرتبط باشد. این مناطق تحت عنوان مناطق فاکتور آزواسپرمی (AZF)نام گذاری می شوند.

انواع ژن ها و حذف های لوکوس AZF

همانطور که در قسمت بالا توضیح داده شد، حذف های ناحیه AZF به subregion های مختلفی طبقه بندی می گردد که در ادامه به معرفی این نواحی و ژن های آن می پردازیم.

منطقه AZFa در کروموزوم Y

ناحیه AZFa دارای طول تقریبی 792 kb است که در سال 1999 به صورت کامل توالی یابی شد. این منطقه توسط دو عنصر رتروویروس درون زا انسانی (human endogenous retrovirus) یا HERV احاطه (flanked) شده است که هر کدام تقریبا 10 kb را پوشش می دهند. ناحیه AZFa از دو ژن USP9Y (ubiquitin specific peptidase 9, Y-linked) و DDX3Y که نماد اختصاری DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, Y-linked است، تشکیل شده است. این دو ژن تنها دارای یک کپی هستند، همولوگ کروموزوم X بوده و بیان دائمی دارند. نقش دقیق این ژن‌ها در فرآیند اسپرم‌ زایی نسبتاً ناشناخته است اما احتمالا حذف هر دو ژن مرتبط با پیامدهای فنوتیپی در male germline خواهد بود.

USP9Y

ژن USP9Y از 46 اگزون تشکیل شده و 159 kb از DNA ژنومی را در بر می گیرد. پروتئین USP9Y یک پروتئاز خاص یوبیکوئیتین (ubiquitin-specific protease) و عضوی از خانواده سیستئین پپتیداز C19 می باشد. عملکرد این دسته از آنزیم‌ ها، تسهیل جدا سازی داخل سلولی مولکول‌ های یوبی‌ کوئیتین از پروتئین ‌های یوبی‌کوئیتین شده است. اما به طور کلی، نقش USP9Y در تنظیم protein turnoverدر طول اسپرم زایی پیشنهاد شده است. ژن USP9Y دارای 91% هومولوژی با ژن USP9X که روی کروموزوم X واقع شده، می باشد. این امر می تواند نشان دهد که محصول هر دو ژن بر روی ملکول های هدف مشابهی تاثیر می گذارند و از لحاظ عملکرد دارای هم پوشانی هستند.

بررسی های مختلف نشان می دهند که حذف یا جهش USP9Y ممکن است در بیماران نابارور مشاهده گردد. با این حال، در نتایج یک مطالعه گزارش شده است که اسپرم زایی طبیعی در فردی با حذف کامل USP9Y ناحیه AZFa رخ می دهد. بنابراین، USP9Y برای اسپرم‌ زایی طبیعی مورد نیاز نیست، اما ممکن است اثرات خود را بر باروری در ترکیب با سایر ژن ‌های کاندید بالقوه در ناحیه AZFa اعمال کند.

DDX3Y

پروتئین DDX3Y دارای نشانه ‌های یک RNA هلیکاز وابسته به ATP (ATP-dependent RNA helicase) است که متعلق به خانواده پروتئینی DEAD box (دارای موتیف حفاظت شده Asp-Glu-Ala-Asp) می باشد. نقش مولکولی دقیق پروتئین DDX3Y هنوز ناشناخته است. اما به طور کلی، پروتئین ‌های خانواده ی DEAD box در چندین فرآیند کلیدی متابولیسم RNA مانند تغییر ساختار ثانویه، پیرایش، spliceosome assembly و شروع ترجمه دخیلند. ژن DDX3Y دارای 91.7% همولوژی با ژن DDX3X است که بیان آنها به صورت دائمی می باشد. بیان این دو ژن در بیضه به حداکثر خود می رسد.

ناحیه AZFb در کروموزوم Y

لوکوس AZFb در ناحیه میانی کروموزوم Y با موقعیت Yq11 واقع شده است. AZFb حدود 6.2 Mb تا 7.7 Mb از توالی MSY را در بر می گیرد و حدود 1.5 Mb با لوکوس AZFc هم پوشانی دارد. ناحیه AZFb از چندین ژن که شامل ژن های تک نسخه ای (single copy genes) و همچنین خانواده ژنی با چند نسخه (multicopy gene families) می باشد. در ادامه به معرفی ژن های این لوکوس پرداخته می شود که عبارتند از:

ژن های تک نسخه ای

CYorf15

ژن CYorf15 (chromosome Y open reading frame 15A and 15B) دارای یک ژن همولوگ روی کروموزوم X به نام CXorf15 است که متعلق به خانواده Taxilin می باشد. این خانواده پروتئینی با تنظیم رونویسی در استئوبلاست ها مرتبط هستند اما به طور کلی هنوز عملکرد دقیق CYorf15 مشخص نشده است.

RPS4Y2

RPS4Y2 (Ribosomal protein S4 Y isoform 2) از دیگر ژن های تک نسخه ای در ناحیه AZFb است. بیان این ژن مختص بافت بیضه می باشد بنابراین ممکن است به طور بالقوه نقشی در تنظیم پس از رونویسی برنامه اسپرم زایی ایفا کند.

EIF1AY

EIF1AY (eukaryotic translation initiation factor 1A, Y-linked) دارای بیان دائمی است که همولوگ آن ژن EIF1AX است. پروتئین های EIF-1A، جهت بیوسنتز پروتئین ها با سرعت بالا مورد نیاز هستند زیرا آنها تفکیک ریبوزوم را به زیر واحدها افزایش داده و اتصال کمپلکس 43S را به انتهای capped RNA تثبیت می کنند.

KDM5D

KDM5D (lysine (K)-specific demethylase 5D) یک هیستون H3 لیزین 4 (H3K4) دمتیلاز را کد می کند که یک کمپلکس پروتئینی با فاکتور ترمیم MSH5 DNA در طول اسپرم زایی تشکیل می دهد. این کمپلکس در طول مرحله لپتوتن/زیگوتن در DNA متراکم شده قرار می‌گیرد که این امر نشان‌ دهنده دخالت در بازسازی کروماتین male germ cell می باشد. بر این اساس، KDM5D ممکن است از طریق دمتیلاسیون کردن H3K4 دی و تری متیله (demethylating di- and tri-methylated H3K4)، در تراکم کروموزوم در حین تقسیم میوز نقش داشته باشد.

ژن های چند نسخه ای

XKRY

ژن XKRY (XK, Kell blood group complex subunit-related, Y-linked) تنها در سلول های بیضه بیان می گردد. این ژن دارای دو نسخه فعال yel3 و yel4 است که کد کننده پروتئین multipass transmembrane transport بوده و دارای شباهت با پروتئین XK می باشد. محل قرار گیری این پروتئین در غشای سلول های عصبی عضلانی و هماتوپوئیتیک می باشد. عملکرد دقیق این ژن در فرآیند اسپرماتوژنز هنوز مشخص نیست.

HSFY

HSFY (heat shock transcription factor, Y-linked) پروتئینی را کد می کند که متعلق به خانواده heat shock factor از فعال کننده های رونویسی است. این ژن نیز در سلول های بافت بیضه بیان می شود. محصول ژن HSFY در سلول های اسپرماتوژنیک (spermatogenic cells) تا مرحله اسپرماتید و همچنین در سلول های سرتولی (Sertoli cells) شناسایی شده است.

PRY

PRY (PTPN13-like, Y-linked) دو واحد عملکردی را در ناحیه AZFb به نام های PRY1 و PRY2 و همچنین دو نسخه کوتاهتر در ناحیه AZFcبه نام های PRY3 و PRY4 را کد می کند. پروتئین های PRY1 و PRY2 تنها در بافت بیضه مشاهده شده اند اما بیان PRY در germ cells به صورت نامنظم بوده و تنها در تعداد محدودی از اسپرم ها و اسپرماتید ها یافت شده است. نتایج مطالعات مختلف نشان می دهند که PRY در آپوپتوز سلول های زایای مردانه نقش دارد زیرا تقریباً 40 درصد از سلول های PRY مثبت، دچار تکه تکه شدن DNA می شوند.

RBMY1A1

خانواده ژنی RBMY1A1 (RNA binding motif protein, Y-linked, family 1, member A1) در سال 1990 شناسایی شدند. RBMY1A1 بخشی از خانواده ژن RBM است که با RBMX همولوگ می باشد. مشخصه اصلی این خانواده وجود موتیف N-terminal RNA recognition (RRM) بوده که مسئول برهمکنش با مولکول های RNA هدف است. RBMY1A1 تنها در male germ cells بیان شده و اغلب در هسته سلول ها مشاهده می گردد. در حالی که همولوگ آن (RBMX) در همه سلول ها بیان می شود.

ناحیه AZFc کروموزوم Y

بروز حذف در ناحیه AZFc، شایع ترین microdeletion در کروموزوم Y است که حدود 80% را شامل می شود. حذف این ناحیه از نوترکیبی همولوگ بین 229 kb direct repeats b2 و b4 نشات گرفته و منجر به deletion یک ناحیه 3.5 Mb متشکل از 21 کپی ژن می گردد. حذف کامل AZFc که منجر به آزواسپرمی می شود. در ناحیه AZFc سه خانواده ژنی کد کننده پروتئین قرار دارد که ادامه به معرفی آنها پرداخته می شود.

BPY2

خانواده ژنی BPY2، نوعی پروتئین های بسیار باردار (highly charged) که مختص بافت بیضه هستند را کد می کنند. این پروتئین ها احتمالا با تنظیم اسکلت سلولی در فرآیند اسپرم‌ زایی مرتبط می باشند. تا امروز ناحیه همولوگ با ژن BPY2 شناسایی نشده است. سازمان دهی ژن BPY2 منحصر به فرد است زیرا از 9 عدد اگزون تشکیل شده اما تنها 5 اگزون آن به آمینواسید ترجمه می گردد.

CDY

CDY (chromodomain protein family) از دیگر خانواده های ژنی واقع در ناحیه AZFc می باشد که از دو Y-encoded genes به نام های CDY1 و CDY2 و همچنین دو نسخه اتوزومی CDYL در کروموزوم 6 و CDYL2 در کروموزوم 16تشکیل شده است. این ژن ها در بازسازی هسته ای پس از میوز و تنظیم رونویسی نقش دارند. نتایج مطالعات مختلف نشان داده که نسخه های مرتبط با کروموزوم Y بیان اختصاصی بیضه دارند در حالی که نسخه های اتوزومی یک الگوی بیان کلی تری را نشان می دهند. پروتئین CDY دارای دو موتیف عملکردی کرومودومین (N-terminal chromatin-binding domain) و دومین (domain) کاتالیتیک c-terminal می باشد. وجود کرومودومین (chromodomain) نشان دهنده دخالت پروتئین در بازسازی کروماتین و تنظیم بیان ژن است.

DAZ

اعضای خانواده ژنی DAZ پروتئین های متصل شونده به RNA (RNA binding proteins) را کد می کنند که نقش مهمی در ایجاد و پایداری male germ line ایفا می کنند. ژن‌های DAZ چهار ایزوفرم پروتئینی را کد می‌کنند که از نظر تعداد domain های عملکردی متفاوت هستند. نتایج مطالعات نشان می دهد که هر چهار ایزوفرم این خانواده ژنی در بافت بیضه انسان بیان می ‌شوند. علاوه بر این، این DAZ در اسپرماتوگونی بیان شده و پروتئین حاصل از آن در سیتوپلاسم سلول ها شناسایی شده اند. به طور کلی، ژن های ناحیه AZFc نقش مهمی در باروری مردان داشته و اکثر مطالعات منتشر شده بر روی بررسی عملکردی CDY و DAZ تمرکز دارند.

مکانیسم انجام microdeletion ها

YCMs ها اغلب به دلیل اشتباه در نوترکیبی همولوگ (homologous recombination) رخ می دهند. حذف های AZFa ناشی از نوترکیبی داخل کروموزومی همولوگ (homologous intrachromosomal recombination) بین دو توالی رتروویروسی درون زا انسانی HERV15yq1 و HERV15yq2 ایجاد می شود که در ناحیه پروگزیمال کروموزوم Y با موقعبت Yq11 قرار دارند. حذف کامل AZFb نیز از طریق نوترکیبی همولوگ بین پالیندروم P5 و بازوی پروگزیمال پالیندروم P1 در بازوی Yq ایجاد می شود. علاوه بر این، حذف‌های AZFc از طریق نوترکیبی همولوگ بین sub-amplicons b2 و b4 در پالیندروم ‌های P3 و P1 رخ می دهد. نوترکیبی غیر همولوگ بین P5/Distal-P1 یا بین P4/Distal-P1 نیز ممکن است منجر به حذف AZFbc شود.

روش های تشخیص فاکتور آزواسپرمی AZF

در مردانی که دچار مشکلات مرتبط با ناباروری از جمله آزواسپرمی (azoospermia) و الیگوزواسپرمی شدید (severe oligozoospermia) (وجود کمتر از 5 میلیون اسپرم در هر میلی لیتر) هستند، اغلب انجام آزمایش فاکتور آزواسپرمی AZF توصیه می گردد. این آزمایش ژنتیک با کمک روش های مختلفی قابل انجام است که در ادامه بر معرفی آنها پرداخته می شود.

Multiplex-PCR

Multiplex-PCR، یک روش استاندارد طلایی برای آزمایش فاکتور آزواسپرمی جهت تشخیص microdeletion های کروموزوم Y است که به منظور تکثیر بخش ‌های کوچکی از هر ناحیه مورد استفاده قرار می گیرد. از مزایای این تکنیک می توان به ساده بودن، حساسیت بالا، سریع و قابل تکرار بودن آن اشاره کرد. در این تکنیک پرایمرهای مختلفی برای ژن های نواحی AZFa، AZFb و AZFc طراحی می شود و استفاده از یک ژن کنترل داخلی مانند ZFY می توانند دقت نتایج حاصل را افزایش دهد.

fluorescent PCR

از دیگر انواع روش PCR که کاربرد گسترده ای در تشخیص فاکتور آزواسپرمی دارد می تواند به fluorescent PCR و Capillary electrophoresis اشاره کرد. در این روش برای مارکرهای STS (sequence-tagged sites) مختلف در لوکوس های AZFa، AZFb و AZFc پرایمرها و پروب های نشان دار مختلفی طراحی می شود. در ابتدا مارکرها با کمک روش fluorescent PCR تکثیر شده و در مرحله بعد محصولات حاصل از آن با استفاده از کاپیلاری الکتروفورز (capillary electrophoresis) تفکیک و بررسی خواهند شد. این روش امروزه به صورت گسترده در انجام آزمایش ژنتیکی AZF در حال استفاده است. امروزه کیت های تشخیص AZF مختلفی در بازار موجود هستند که هر یک نواع مختلفی از مارکر STS در کروموزوم Y را بررسی می کنند. در تصویر زیر انواع مارکر های STS نشان داده شده است.

aCGH

از دیگر تکنیک های کاریردی در زمینه تشخیص فاکتور آزواسپرمی AZF می توان به aCGH (Array comparative genomic hybridization) اشاره کرد که به بررسی تعداد کپی واریانت ها (CNVs) می پردازد. Copy number variations یا CNV پدیده ای است که در آن بخش ‌هایی از ژنوم که دچار حذف یا مضاعف سازی می شود. در این حالت طول و تعداد تکرارها بین دو فرد سالم و بیمار متفاوت خواهد بود. به این ترتیب، با استفاده از پرایمر ها و پروب های نشان می توان CNV ها را شناسایی نمود. دقت این تکنیک در تشخیص CNVs ها بسیار بالاتر از Multiplex-PCR می باشد.

آزمایش آزواسپرمی

زمانی که زوجین به دلیل مشکلات نباروری به پزشک مراجعه می کنند، در اغلب موارد اورولوژیست انجام آزمایش آزوسپرمی را برای آقا به آزمایشگاه درخواست می دهد. در این نوع تست نمونه مورد بررسی مایع منی است که از لحاظ تعداد اسپرم های موجود مورد بررسی قرار می گیرد. در صورتی که در آزمایش آزواسپرمی فرد مراجعه کننده اسپرمی مشاهده نشود، آزواسپرمی یا عدم اسپرم گزارش خواهد شد.

زمان درخواست آزمایش آزواسپرمی

یکی از سوالات متداول زوجین که جهت مشکلات ناباروری به پزشک مراجعه می کنند، این است که کی باید آزمایش آزواسپرمی بدهیم؟ یکی از متداول ترین تست ها جهت تشخیص و علت ناباروری در مردان، انجام آزمایش آزواسپرمی است. زمان درخواست آزمایش آزواسپرمی معمولا در مراحل اولیه درمان ناباروری است اما در برخی موارد که آقا دچار مشکلاتی نظیر واریکوسل باشد نیز پزشک این تست را تجویز می کند.

تحلیل آزمایش آزواسپرمی

در آزمایش آزواسپرمی نمونه مایع منی از لحاظ حجم، کیفیت، تعداد اسپرم ها و سالم بودن آن ها مورد ارزیابی قرار می گیرد. در حال نرمال، در هر بار انزال حدود 3 تا 5 میلی لیتر مایع منی از آقا خارج می شود که دارای تقریبا 15 میلیون اسپرم در هر CC می باشد. یکی دیگر از فاکتورهایی که در تحلیل آزمایش آزواسپرمی مورد بررسی قرار می گیرد، مورفولوژی یا ظاهر اسپرم ها است که از لحاظ طبیعی بودن دم و سر ارزیابی خواهند شد. در صورتی که فرد مراجعه کننده نیاز به بررسی های ژنتیکی داشته باشد، تست فاکتور AZF نیز توسط پزشک برای او درخواست داده می شود. بررسی مولکولی AZF یکی از تست های رایج در تشخیص علت آزواسپرمی و ناباروری در مردان می باشد. تحلیل آزمایش AZF اغلب توسط پزشک متخصص انجام می شود. در زمان بررسی ناباروری به دلیل AZF ژن های مختلفی که در نواحی AZFa، AZFb و AZFc قرار دارند از لحاظ بروز جهش های مختلف مورد بررسی قرار خواهند گرفت.

سوالات متداول

آیا مشکل آزواسپرمی قابل حل است؟

آزواسپرمی می تواند به دلایل مختلفی در آقایان ایجاد شود که با توجه به علت آن، روش های درمانی مختلفی توسط پزشک معالج تجویز خواهد شد. در صورتی علت بروز آزواسپرمی مشکلاتی نظیر واریکوسل باشد، اغلب جراحی توصیه می گردد. واریکوسل شایع ترین عامل ناباروری در مردان است که باعث ایجاد انسداد در مسیر خروج اسپرم و در نهایت آزواسپرمی می باشد. در صورتی علت علت بروز آزواسپرمی اختلالات هورمونی باشد، مصرف برخی داروها می توانند در القای تولید اسپرم موثر باشند.

آیا افراد دارای مشکل آزواسپرمی می توانند بچه دار شوند؟

آزواسپرمی انواع مختلفی دارد که در برخی موارد مانند پیش بیضه ای یا بعد از بیضه ای، با مصرف برخی دارو و جراحی مشکل برطرف شده و فرد قدرت باروری خود را بدست می آورد. اما در موارد که علت آزواسپمی بیضه ای باشد، درمانی وجود نداشته و فرد باید جهت باروری از اسپرم های اهدایی استفاده کند.

بهترین شیوه درمان AZF چیست؟

در صورتی علت ناباروری در مردان وجود مشکلات ژنتیکی در آزمایش AZF تشخیص داده شود، اغلب بیمار به مشاوره ژنتیک ارجاع داده می شود. در این حالت استفاده از روش های کمک باروری مانند IVF و یا استفاده از اسپرم اهدایی صورت می گیرد. به طور کلی، نوع روش درمان AZF بستگی به علت ایجاد آن دارد.

چه زمانی برای بررسی مشکل آزواسپرمی باید به پزشک مراجعه کرد؟

اغلب زوجینی که پس از عدم موفقیت بارداری به پزشک متخصص مراجعه می کنند، در مرحله اول باید تست هایی نظیر آزمایش آزواسپرمی و تست AZF را انجام دهند تا علت ناباروری مشخص شود. علاوه بر این، برخی آقایان که دچار مشکلاتی نظیر واریکوسل هستند اغلب پس از جراحی آزمایش آزواسپرمی را انجام می دهند تا نتیجه عمل و موفقیت آن مشخص گردد. از دیگر مواردی که آقایان جهت بررسی آزواسپرمی به پزشک مراجعه می کنند، پس از انجام عمل وازکتومی است که جهت بررسی وجود اسپرم در مایع منی انجام می گردد.