روش های استخراجDNA(DNA Extraction Methods)

فرایند استخراج و خالص سازی اسید های نوکلئیک شامل مجموعه ای از مراحل است که در نهایت منجر به حصول اسید نوکلئیک (DNA یا RNA) با خلوص مشخص و عاری از هر گونه ناخالصی می شود. استخراج اسید‏های نوکلئیک معمولا با هدف تهیه DNA یا RNA جهت انجام بررسی های متعاقب مانند تشخیص مولکولی بیماری ها و یا بررسی های پزشکی قانونی انجام می شود. دسترسی به اسید نوکلیئک خالص اولین مرحله از هر نوع آزمایش مبتنی بر تکثیر اسید های نوکلئیک و نقطه شروع بررسی های مولکولی در سطح ژن ها می ‏باشد. بنا بر این کیفیت نوکلئیک اسید استخراج شده عامل مهمی در صحت و درستی نتایج تست های تشخیصی متعاقب است. کاربرد استخراج اسیدهای نوکلئیک محدود به علم پزشکی و بیولوژی نبوده و در بسیاری از حوزه ها مانند کشاورزی، دامپزشکی، باستان شناسی و … تاثیر گذار است.
با توجه به هدف مطالعه و نمونه های در دسترس، اسید های نوکلئیک را می توان از منابع مختلف استخراج کرد؛ تمام سلول ها و بافت های مختلف انسانی و حیوانی مانند خون، بزاق، مو، ادرار، مدفوع، دندان و استخوان منابع استخراج DNA و یا RNA هستند. به عنوان مثال برای تشخیص بیماری های ژنتیکی مثل تالاسمی، دستروفی عضلانی دوشن، هانگتینتون و سیستیک فیبروزیس از DNA استخراج شده از سلول های خونی استفاده می شود. برای تشخیص عفونت های ویروسی مانند HIV و HBV از سرم و پلاسما استخراج انجام می شود. جهت ردیابی حضور ویروس هرپس و عفونت ها و تورم مغزی (آنسفالیت) می توان از DNA و RNA استخراج شده از مایع مغزی-نخاعی استفاده کرد. حضور سلول های توموری مربوط به دستگاه گوارش با استفاده از اسید نوکلیئک استخراج شده از نمونه مدفوع بررسی می شود. بسیاری از بیماری های ژنتیکی پیش از تولد نوزاد با بررسی DNA استخراج شده از نمونه مایع آمنیوتیک، پرزهای جنینی و بلاستومر قابل تشخیص هستند. در بررسی ‌های جنایی و پزشکی قانونی نیز استخراج DNA از نمونه هایی مثل ته سیگار، آدامس و حتی گرد و خاک موجود در فضای بررسی قابل انجام است؛ زیرا احتمال وجود سلول های پوست و موی مظنونین در این نمونه ها وجود دارد. همچنین سلول ها و بافت های گیاهی مثل برگ، میوه و چوب نیز منابع استخراج اسید های نوکلئیک هستند. در برخی موارد لازم است اسید نوکلئیک مورد نظر از روی ژل (آگارز یا آکریل آمید) و یا از محصول به دست آمده از واکنش PCR استخراج و خالص سازی شود.
هر چند استخراج اسید های نوکلئیک از منابع مختلف و با روش های مختلفی انجام می شود، اما مراحل اصلی استخراج با اهداف مشابهی انجام می شود. هدف از انجام مراحل مختلف فرایند استخراج هضم پوشش سلول (غشا یا دیواره سلولی) و حذف لیپیدها، پروتئین ها و سایر ناخالصی‌ ها جهت دستیابی به مولکول های DNA و یا RNA خالص است. این مراحل عبارتند از 1) لیز سلول ها برای آزاد شدن اسید نوکلئیک، 2) خالص سازی اسید نوکلئیک و 3) رسوب دادن، شستشو و تغلیظ.
1) روش های مختلفی برای لیز سلولی وجود دارد که به طور کلی به دو گروه شیمیایی و مکانیکی طبقه بندی می شوند؛ روش های شیمیایی شامل هضم آنزیمی (پروتئیناز یا لیزوزیم)، شوک اسمزی (استفاده از عامل های کائوتروپیک)، استفاده از دترجنت ها، تیمار قلیایی و … است و روش های مکانیکی شامل خرد کردن، آسیاب کردن، ساییدن در هاون در حضور نیتروژن مایع، استفاده از امواج فراصوت توسط سونیکاتور و … می باشد. روش های مکانیکی سبب شکسته شدن مولکول های DNA می شوند؛ بنابراین در مواردی که به قطعات سالم و کامل DNA نیاز است بهتر است از هضم آنزیمی (لیزوزیم و پروتئیناز K) و شوینده ها برای لیز سلولی استفاده شود. عصاره سلولی حاصل از هضم سلول ترکیبی از اسید های نوکلئیک، پروتئین ها و چربی هاست؛ حذف این ناخالصی ها از اسید نوکلئیک مورد نظر را خالص سازی می گویند.
2) روش های خالص سازی اسیدهای نوکلئیک نیز متنوع است و به طور کلی شامل روش های solution-based و روش های Column-based می شود. این مرحله شامل حذف ناخالصی ها، چربی ها و پروتئین هاست؛ استفاده از محلول فنل-کلروفرم یکی از روش های خالص سازی است؛ فنل باعث دناتوره شدن پروتئین می شود و بعد از سانتریفیوژ کردن پروتئین رسوب کرده و فاز آبی حاوی اسیدهای نوکلئیک است. یکی از روش های دیگر استفاده از ستون های خالص سازی است؛ اسید های نوکلئیک بر اساس pH و غلظت نمک روی یک سطح جامد (solid phase) مانند سیلیکا یا مواد دیگر متصل شده و از سایر ناخالصی‌ها جدا می شوند.
3) مرحله رسوب دادن اسیدهای نوکلئیک با استفاده از الکل هایی مثل اتانول و ایزوپروپانول انجام می شود؛ از آنجایی که اسید های نوکلئیک در الکل نامحلول هستند، به کمک سانتریفیوژ کردن رسوب کرده و از سایر مولکول ها جدا می شوند.
به طور کلی روش های استخراج و خالص سازی اسیدهای نوکلئیک را می توان به دو گروه روش های شیمیایی (Chemical-drived method) و روش های فاز جامد (Solid-phase method) طبقه بندی کرد. روش های شیمیایی با تکیه بر ویژگی های بیوشیمیایی مولکول ها به استخراج مولکول دلخواه می ‏پردازند در حالی که روش های فاز جامد بر اساس فاز مایع و فاز ثابت و خواص یونی، هیدروفوبی و قطبیت مولکول دلخواه و یک ماده جاذب عمل می کنند و نوع پیوند (وان دروالسی، یونی و هیدروژنی) بین مولکول مورد نظر و جاذب اساس روش را تعیین می کند.
روش شیب چگالی سزیم کلرید یکی از روش های شیمیایی استخراج اسیدهای نوکلئیک است؛ اساس این تکنیک استقرار اسید نوکلئک در نوار اختصاصی خود در شیب چگالی سزیم کلرید است، در این روش محلول سزیم کلرید و عصاره سلولی برای چند ساعت سانتریفیوژ می شوند و در شیب چگالی به وجود آمده مولکول ها بر اساس چگالی شناوری ویژه خود تفکیک می شوند. پروتئین ها دانسیته کمتری دارند و RNA و پلازمید های دارای سوپرکویل نسبت به DNA دارای دانسیته بیشتری هستند. در نهایت برای مشاهده باند DNA از اتیدیوم برماید استفاده می شود. این روش در استخراج پلازمید کاربرد دارد. استخراج پلازمید ها از کشت باکتری مانند روش کلی خالص سازی DNA از سلول است؛ اما در استخراج پلازمید لازم است که DNA پلازمیدی از مقدار زیادی DNA باکتریایی موجود در سلول جدا شود. برای این منظور روش های مختلفی وجود دارد که یکی از آن ها شیب چگالی سزیم کلرید است.
استخراج قلیایی نیز در جدا سازی DNA پلازمیدی از DNA کامل کاربرد دارد؛ الکل باعث دناتوره شدن DNA کامل می شود اما با پیوند کووالانسی به DNA پلازمیدی متصل می شود. پس از خنثی سازی DNA کامل به حالت اولیه برگشته و رسوب می کند درحالی که DNA پلازمیدی در فاز آبی می ماند.
استفاده از محلول گوانیدین تیوسیانات-فنل-کلروفرم و سانتریفیوژ کردن نیز یکی دیگر از روش های شیمیایی استخراج است که در استخراج تک مرحله ای RNA کاربرد دارد. در این روش پس از سانتریفیوژ کردن، مولکول های RNA در فاز آبی (بالایی) و DNA و پروتئین ها در فاز میانی یا پایین تر قرار می گیرند.
یکی دیگر از روش های شیمیایی استفاده از محلول Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) است؛ این ماده نوعی دترجنت است که با اسید های نوکلئیک کمپلکس تشکیل داده و رسوب می کند درحالی که به بقیه مواد موجود در عصاره سلولی متصل نمی شود. رسوب به دست آمده با نمک شستشو داده می شود و اسید نوکلئیک با استفاده از الکل رسوب داده می شود. این روش برای استخراج اسید نوکلئیک از بافت های گیاهی کاربرد دارد.
یکی دیگر از روش های شیمیایی، استفاده از ذرات Chelex است؛ Chelex ذرات آنیونی مصنوعی هستند که به صورت جاذب یون های چند ظرفیتی مثل منیزیم عمل می‏کنند؛ حذف این یون ها باعث تخریب و غیر فعال شدن آنزیم های هیدرولیز کننده DNA می شود.
از روش های مبتنی بر فاز جامد می توان به کروماتوگرافی با رزین های Anion Exchange و ماتریکس های متصل شونده به اسیدهای نوکلئیک اشاره کرد. ملکول های اسید نوکلئیک با بار منفی تمایل به اتصال به ذراتی از جنس سیلیکا، شیشه و یا سلولز با بار مثبت دارند، درحالی که دیگر مولکول های موجود در عصاره سلولی اینگونه نیستند و به راحتی با شستشو حذف می شوند. اتصال موثر اسیدهای نوکلئیک به سیلیکا اساس عملکرد تکنولوژی ستون های حاوی غشاهای سیلیکایی است.
جهت استخراج DNA از ژل آگارز و محصول PCR نیز استفاده از روش های مبتنی بر ستون کاربرد دارد. برای این منظور باید از درصدهای پایین تر آگارز استفاده شود. پس از الکتروفورز و تفکیک DNA بر حسب اندازه، قطعه مورد نظر برش داده می شود و با استفاده از کیت های استخراج از ژل که واجد سیستم بافری مناسب جهت هضم ژل و ستون های حاوی غشای سیلیکایی DNA خالص سازی می شود.
روش Magnetic Beads نیز یکی دیگر از روش های فاز جامد است؛ در این روش ذرات مغناطیسی عامل دار شده به همراه سیستم بافری مناسب به صورت اختصاصی اسید نوکلئیک مورد نظر را از عصاره سلولی جدا می کند.
از آنجایی که روش های استخراج و خالص سازی بسیار متنوع است، برای انتخاب روش و تکنیک استخراج و خالص سازی اسید های نوکلئیک باید عواملی مانند هدف استخراج، نوع آنالیزهای پایین دستی (PCR، Cloning، blotting و ….) ، نوع اسید نوکلئیک هدف (ssDNA، dsDNA، total RNA، mRNA و …)، ارگانیزم منشاء (گیاه، جانور، پروکاریوت، ویروس و …)، نوع نمونه (اندام، بافت، کشت سلولی، خون و …) و نتیجه مورد انتظار (خلوص، بازدهی، زمان لازم برای استخراج) را در نظر گرفت. بسیاری از روش های استخراج اسید های نوکلئیک که برای انواع مولکول های DNA (ژنومی، پلازمید و ….) به کار می رود، با اندکی تغییر برای انواع مولکول‏های RNA (mRNA، tRNA، miRNA و …) نیز قابل استفاده هستند. در واقع هنگام استخراج اسید های نوکلئیک DNA و RNA با هم خالص می شوند و با روش هایی باید DNA عاری از RNA و یا RNA عاری از DNA به دست آورد. RNA مولکولی ناپایدار است و نیمه عمر کوتاهی دارد، بنا بر این باید از نمونه های تازه جهت استخراج RNA استفاده شود. روش های آزمایشگاهی استخراج RNA باید مبتنی بر روش های عاری از RNase باشد. در استخراج RNA حذف مواد زائد اهمیت زیادی دارد و استفاده از ترکیباتی مانند ترایزول، کلروفرم و ایزوپروپانول باعث حذف لیپیدها، کربوهیدرات ها، پروتئین ها و DNA می شود.
امروزه روش‏های مولکولی به دلیل حساسیت و اختصاصیت بالا جایگاه ویژه ای در تشخیص بیماری های ژنتیکی و عفونی دارند؛ لازمه انجام تست های تشخیصی مولکولی، استخراج اسیدهای نوکلئیک است. یک روش بهینه استخراج روشی سریع، مقرون به صرفه، ایمن و دارای حساسیت و اختصاصیت بالا است. با این حال هر روش معایب و مزایایی دارد و باید با توجه به هدف مطالعه و نوع نمونه روش مناسب انتخاب شود.
یکی از جنبه های کاربرد استخراج DNA در حوزه پزشکی، تشخیص پیش از تولد بیماری های ژنتیکی است؛ برای این منظور مولکول های DNA از مایع آمنیوتیک و یا پرزهای جنینی استخراج می شود. روش انتخاب شده برای این هدف باید باعث حصول DNA با خلوص و کیفیت مناسب برای استفاده در واکنش‌ های پایین دستی باشد. در گذشته به طور سنتی روش فنل-کروفرم و رسوب با الکل برای استخراج DNA از مایع آمنیوتیک و پرزهای جنینی استفاده میشد؛ روش‏ های سنتی زمان بر، گران قیمت و نیازمند استفاده از مواد سمی و خطرناک هستند. امروزه استفاده از کیت های تجاری مبتنی بر تکنولوژی استخراج ستونی جایگزین روش های سنتی شده است. اساس عملکرد این کیت ها اتصال موثر DNA با غشاهای سیلیکایی است. استفاده از این کیت ها آسان و سریع بوده و DNA حاصل کیفیت لازم برای استفاده در واکنش های پایین دستی را دارد.
واکنش های PCR در تشخیص بسیاری از عوامل عفونت زا کاربرد دارد. با استخراج اسید نوکلئیک از خون امکان تشخیص ویروس، باکتری و قارچ وجود دارد. در خون کامل بازدارنده های PCR مانند هموگلوبین وجود دارد. کیت های تجاری که در پروتوکل آن ها لیز حرارتی و شستشوی قلیایی اعمال می شود به دلیل حذف بازدارنده ها بازیابی بهتری در استخراج DNA دارند. برای استخراج اسید نوکلئیک از خون استفاده از روش های مبتنی بر ستون سریع و آسان است و نیازی به محلول های آلی خطرناک ندارد. اسید نوکلئیک استخراج شده با این روش، خلوص و کیفیت لازم برای واکنش های متعاقب را دارد.
بافت نیز یکی از نمونه ‏های مهم در تشخیص های بالینی است؛ مقاطع بافتی که به روش های هماتوکسیلین ائوزین رنگ آمیزی می شوند و اغلب درفرمالین فیکس شده اند و در بلوک های پارافینی نگهداری می شوند قابلیت استخراج اسید نوکلئیک را دارند. DNA موجود در این نمونه ها را میتوان استخراج و PCR نمود. در ابتدا مقاطع بافتی از بلوک های پارافینی بافت ها برش داده شده و سپس پارافین اطراف مقاطع بافتی ذوب و نمونه رنگ آمیزی شده و روی لام زیر لامل قرار می گیرد. جهت استخراج DNA از چنین نمونه هایی ابتدا بایستی رزین های نگهداری کننده لامل برروی لام را برای مدت 1 تا 2 روز در گزیلن به صورت محلول در آورد. سپس مقاطع بافتی را در لوله میکرو سانتریفوژ تراشیده و با پروتئناز K برای حداکثر 3 روز انکوبه نمود متعاقبا نمونه دپروتئینه شده و بقایای تجزیه شده پروتئین را با اتانول رسوب داده و برای PCR آماده نمود.
یکی دیگر از جنبه های کاربردی استخراج اسیدهای نوکلئیک و تکثیر آن توسط واکنش PCR، مطالعات باستان شناسی مولکولی است؛ این مطالعات بازسازی تطور قومیت های مردم جهان را مسیر می کند. در این مطالعات مولکول های DNA باید از بافت های استخوان، دندان و موی اجساد استخراج شود. این بافت ها باید تحت شرایط خاص به پودر تبدیل شده و سپس با روش مناسب استخراج انجام شود؛ مراحل استخراج DNA از این بافت ها مانند سایر بافت های طبیعی است اما نکته حائز اهمیت در این مطالعات این است DNA پس از مرگ جاندار شروع به زوال می کند و آنزیم های برشی منجر به قطعه قطعه شدن DNA می شوند. همچنین عوامل فیزیکی و شیمیایی، اکسیداسیون و هیدرولیز باعث تخریب ساختار DNA موجود در نمونه های باستانی می شد. بنابراین این نمونه ها غالبا حاوی DNA شکسته با وزن مولکولی پایین و همراه با انواع مختلفی از مهارکننده های PCR هستند. لذا روش مناسب برای استخراج این نوع از DNA باید به دور از شوینده های قوی و دمای بالا یا پایین بوده و قادر به حذف مهارکننده‏ها و بازیابی حداکثر DNA باشد. به عنوان مثال تیمار نمونه استخوان و دندان اجساد کشف شده در منطقه بهشهر مازندران (گوهر تپه) با محلول بافری حاوی EDTA و پروتئیناز K (جهت حذف مهار کننده ها) و سپس استفاده از دانه های سیلیکا (کیت GenejetTM silica bead شرکت فرمنتاس-آلمان) منجر به استخراج موفقیت آمیز DNA از این نمونه ها شده است. روش های استخراج DNA از بافت های استخوان، دندان، مو و ناخن و بررسی های مولکولی متعاقب امکان تفحص شهدای گمنام و تشخیص هویت اجسادی که قابل شناسایی نیستند را فراهم می کند. این تفحص و شناسایی از طریق تطابق اطلاعات ژنتیکی به دست آمده از نمونه با اطلاعات ژنتیکی خانواده فرد انجام می شود. در صورت تهیه بانک ژنی از توالی DNA افراد و اختصاص کارت هویتی به هر فرد می توان در صورت لزوم با وجود یک تار مو یا یک قطره خون هویت فرد را شناسایی کرد.