MLPA

تکنیک MLPA

تکنیک MLPA چیست؟

تغییر در تعداد نسخه های توالی های ویژه ی کروموزومی و حذف ها و مضاعف شدگی ها نشان دهنده ی جهش های بیماری زا هستند که منجر به نشانگان ها یا بیماری های ژنتیکی مختلفی می شوند. روش های متعددی جهت شناسایی و تشخیص این جهش ها و اختلالات کروموزومی وجود دارد که یکی از مهم ترین و پرکاربردترین آنها در اکثر آزمایشگاه های جهان، روش مولکولی MLPA می باشد.
روشMultiplex ligation-dependent probe amplification یا به اختصار MLPA ، یک روش تشخیص مولکولی حساس و مؤثر در آزمایشگاه های تشخيص ژنتیک و پاتوبیولوژی و همچنین در پژوهش پيرامون شناسايي حذف ها و تكثيرهاي ژني می باشد. این روش، نوع تغییر یافته ای از روش Multiplex PCR می باشد که طی آن حداکثر 50 ناحیه ژنی فقط با یک جفت پرایمر تکثیر می گردد و امکان تشخیص و تمایز دادن توالی هایی که تنها در یک نوکلئوتید تفاوت دارند را فراهم می کند. نتایج نهایی از تکنیک MLPA با برنامه های نرم افزاری مشخص، مورد آنالیز قرار می گیرند.
روش مولکولی MLPA اولین بار در سال 2002 توسط Jan Schuten در مجله علمی Nucleic Acid Research معرفی شد و در شناسایی حذف های اگزونی در ژن های انسانی BRCA1،MSH2 و MLH1 که عامل سرطان های ارثی سینه و کولون هستند مورد استفاده قرار گرفت. امروزه از این روش در شناسایی انواع مختلفی از ناهنجاری های ژنتیکی و ارثی که ناشی از جهش های حذفی در محدوده ژنی وسیع هستند شامل α-تالاسمی، β-تالاسمی، دیستروفی عضلانی دوشن (DMD)، سرطان های ارثی سینه و کولون، فنیل کتونوریا (PKU)، سندروم پرادر-ویلی و آنجلمن، عقب ماندگی ذهنی و غیره کاربرد گسترده ای دارد.

اصول عملکرد روش MLPA

به طور کلی، روش MLPA یک multiplex PCR است که برای ارزیابی تعداد کپی نسبی هر توالی DNA از 40 پروب مورد استفاده قرار می گیرد. هر یک از این پروب ها مختص یک توالی DNA متفاوت می باشند (عمدتا اگزون های یک ژن خاص). هر پروب از دو نیم پروب (3′ and 5′ half-probes) جهت بررسی تعداد نسخه هر توالی و یکتوالی پرایمر Universal تشکیل شده است که امکان تکثیر همزمان multiplex PCR را برای همه پروب ها فراهم می کند. علاوه بر این، یک یا هر دو نیم پروب حاوی یک توالی stuffer هستند که امکان تمایز قطعات در طول الکتروفورز را بر اساس طول خود پروب و در نتیجه اندازه محصول تکثیر شده را فراهم می کند.

واکنش MLPA را می توان به پنج مرحله تقسیم کرد:

دناتوراسیون DNA الگو
هیبریداسیون پروب با DNA الگوی واسرشته در ناحیه اختصاصی
لیگاسیون (اتصال) DNA
تکثیر قطعات بوسیله PCR
جداسازی محصولات PCR توسط کپیلاری الکتروفورز
تجزیه و تحلیل داده ها

در مرحله اول، DNA دناتوره شده و پروب های MLPA به DNA متصل می شوند. دو نیم پروب، قادر به تشخیص توالی های هدف خاص هستند که این توالی باید بسیار اختصاصی بوده و دارای تطابق کامل با پروب ها و بدون فاصله (gap) باشد. پس از هیبریداسیون، PCR انجام می شود. PCR فقط با استفاده از یک جفت پرایمر که یکی از آنها با برچسب فلورسانت نشانه گذاری شده اند انجام می گردد. از آنجا که فقط پروب های متصل شده در طول واکنش PCR بعدی تکثیر می شوند، اندازه گیری تعداد محصولات اتصال پروب در برابر تعداد توالی هدف در نمونه است. در نهایت محصولات PCR با استفاده از تکنیک الکتروفورز از نظر اندازه جدا خواهند شد.

ارتفاع یا مساحت پیک ‌های فلورسنت مشتق ‌شده از PCR اندازه‌گیری می ‌شود، مقدار محصول PCR پس از نرمال ‌سازی (normalization) و مقایسه آن با نمونه ‌های DNA کنترل، در نتیجه مقدار نسبی توالی DNA هدف در DNA sample را نشان می ‌دهد. کیفیت واکنش با وجود پیک های کنترل که اطلاعاتی در مورد کارایی تکثیر و مقدار صحیح DNA مورد استفاده برای واکنش ارائه می دهد، ارزیابی خواهد شد. نکته کلیدی در واکنش MLPA این است که PCR توالی های هدف را تکثیر نمی کند، بلکه پروب های بسته شده را تکثیر خواهد کرد. بنابراین، در یک PCR معمولی از یک جفت پرایمر PCR برای تکثیر استفاده می شود، در حالی که در PCR Multiplex به پرایمرهای خاصی جهت تکثیر نیاز است.