QF-PCR

تکنیک QF-PCR

تکنیک QF-PCR چیست؟

حدود 15 درصد از بارداری ها در زنان به سقط جنین ختم می شود که عوامل زیادی در ایجاد این پدیده نقش دارند. یکی از مهم ترین و رایج ترین عواملی که منجر به سقط های زودهنگام جنین و ختم بارداری می شود ناهنجاری های کروموزومی است که 96 درصد آن به ناهنجاری های تعدادی کروموزومی اختصاص دارد. رایج ترین ناهنجاری های تعدادی کروموزومی که تاکنون مشاهده شده است شامل کروموزوم های 13، 15، 16، 18، 21، X و Y می باشد. بسیاری از خانم های بارداری که به دلیل ناهنجاری های کروموزومی دچار سقط جنین شده اند به احتمال بیشتری در بارداری های بعدی با این مشکل روبرو می شوند. در این موارد مطالعات سیتوژنتیکی بسیار حائز اهمیت است. شناسایی عوامل سقط جنین به میزان زیادی از استرس های روانی دراز مدت مادران کاهش داده و لزوم دریافت مشاوره ژنتیک را در بارداری های بعدی تعیین می کند.

هر انسان نرمال ۲۳ جفت کروموزوم دارد که یکی از آنها از مادر و دیگری از پدر به ارث می‌ رسد. ناهنجاری های کروموزومی نتیجه تغییر در تعداد یا ساختار کرموزوم ها می‌ باشند. ناهنجاری در تعداد یا ساختار کروموزوم ها از علل مهم ایجاد نقص های مادرزادی به شمار می روند. در ۹۹% موارد در زمانی که سلول های جنسی پدر یا مادر تشکیل می‌ شود ممکن است سلول مورد نظر واجد یک کروموزوم اضافی باشد. چنانچه چنین سلولی در تشکیل جنین شرکت کند، جنین مبتلا خواهد شد. مطالعات سیتوژنتیک شامل کاریوتایپ و روش FISH نه تنها روش های پرهزینه و زمان بر جهت تشخیص آنیوپلوئیدی هستند، بلکه به دلیل چالش های موجود در فرآیند کشت سلولی، آلودگی های احتمالی و کیفیت نامناسب آماده سازی کروموزوم ها ممکن است نتایج قابل قبولی حاصل نشود و نیاز به تکرار آزمایش ها باشد.

اساس عملکرد تکنیک QF-PCR

به طور کلی، تکنیک QF PCR شامل تکثیر (amplification)، تشخیص (detection) و آنالیز توالی های DNA اختصاصی کروموزوم شناخته شده از طریق مارکرهایی مانند STR ها (Short Tandem Repeats) می باشد. در این روش از پرایمرهای نشان دار شده فلورسنت جهت تکثیر هر مارکر با کمک روش PCR، استفاده می شود و شماره کپی هر نشانگر نشان دهنده تعداد کپی کروموزوم است. پس از اتمام تکثیر قطعات، محصولات PCR حاصل را می توان با استفاده از یک آنالایزر ژنتیکی خودکار آنالیز و کمی سازی نمود.

طول مارکرهای STR با توجه به تعداد تکرارها ممکن است بین کروموزوم ها و افراد مختلف متفاوت باشد. تعداد کپی نسبی هر آلل با محاسبه نسبت نواحی پیک یا ارتفاع پیک شناسایی شده برای هر نشانگر تعیین می شود. یک نمونه دیپلوئید نرمال سهم دو کروموزوم از هر یک از کروموزوم های مورد بررسی را دارد. دو آلل از یک نشانگر اختصاصی کروموزوم به عنوان دو پیک در نسبت 1:1 هنگامی که نشانگر هتروزیگوت است و به عنوان یک پیک زمانی که نشانگر هموزیگوت است (دارای آلل هایی با طول یکسان) تشخیص داده می شود. تشخیص یک آلل اضافی به عنوان سه قله در نسبت 1:1:1 یا به صورت دو پیک در نسبت 2:1/1:2 نشان دهنده وجود یک کپی نشانگر اضافی است که احتمالاً مطابق با یک کروموزوم اضافی می باشد.

امروزه، مطالعات جدید نشان می دهد که روش مولکولی QF-PCR می تواند به عنوان یک روش مکمل در تشخیص آنیوپلوئیدی کروموزومی به کار گرفته شود. در حال حاضر از این روش در کیت تشخیص آنیوپلوئیدی استفاده می گردد. این روش بر اساس تکنیک فلوئورسنت کمی واکنش زنجیره ای پلیمراز (Quantitative Fluorescence-Polymerase Chain Reaction) می باشد که با استفاده از پرایمرهای نشان دار شده با مواد فلورسنت به بررسی مارکرهای ویژه کروموزومی می پردازد.

· نمونه های مورد نیاز برای آزمایش QF-PCR

سونوگرافی و آزمایش های دو گانه، سه گانه و یا چهار گانه (Double, Triple or Quadruple Test) درهفته دهم و یازدهم بارداری توسط متخصص زنان وضعیت جنین تا حد زیادی مشخص خواهد شد که دقت این آزمایش ها حداکثر 85% می باشد. در صورت مشکوک بودن نتایج آزمایش های فوق و یا سن بالاتر از 35 سال در مادران باردار، بررسی ژنتیکی کروموزوم ها ضرورت دارد. از آنجایی که در ایران بعد از هفته 18 بارداری سقط جنین غیر قانونی می ‏باشد لازم است نتایج همه آزمایش ها تا قبل از اتمام هفته 18 بارداری مشخص شوند. لذا توصیه می شود بعد از هفته 15 بارداری از روش بررسی سریع اختلالات کروموزومی به نام QF-PCRاستفاده شود.

· مدت زمان پاسخ دهی آزمایش QF-PCR

روش QF-PCRسریع و نسبتا ارزان می باشد و در مدت 48 ساعت بعد از نمونه گیری، نتایج قابل اطمینانی را فراهم می آورد. این روش از روش های معمول سیتوژنتیکی سریع تر و ارزان ‏تر است و دقت آن بیش از 99% می باشد. در صورتی که علائم و نشانه های مشخص بالینی ابتلا به بیماری در جنین وجود داشته باشد، کاریوتایپ نیز به همراه این آزمایش صورت می گیرد. در حال حاضر، از نظر پزشکی قانونی، نتایج QF-PCR به تنهایی جهت مجوز ختم بارداری کافی نمی باشد و باید تکنیک دیگری مانند MLPA نتایج آن را تایید کند تا اجازه ی ختم بارداری داده شود. در شرایط محدودیت زمانی، آزمایش QF-PCR و MLPA به صورت همزمان با کاریوتایپ انجام می شود.

کاربردهای روش QF-PCR

تشخیص سریع ناهنجاری تعدادی کروموزم‎ های 13، 18، 21، X و Y شامل سندرم پاتو (تریزومی ۱۳)، سندرم ادوارد (تریزومی ۱۸)، سندرم داون (تریزومی ۲۱)، سندرم ترنر(45,XO)، سندرم کلاین فلتر (47, XXY)، سندرم ژاکوبز (47, XYY) و سندرم triple X (47,XXX)
بررسی سلامت جنین در صورت مشکوک بودن نتایج غربالگری سه ماهه اول
تعیین جنسیت جنین
تشخیص انواع پلی پلوئیدی(تریپلوئیدی) در جنین یا جنین سقط شده
بررسی سریع اختلالات کروموزومی در مواردی که امکان کشت سلولی فراهم نباشد و یا زمان کافی برای کشت سلولی ندارند.
بررسی کروموزومی نمونه جنینی در خانم های باردار مستعد احتمال اختلال کروموزومی که شامل درخواست آزمایش کروموزومی حین بارداری توسط پزشک، سن بالای 35 سال مادر در هنگام بارداری، مشاهده جواب آزمایشات حین بارداری موسوم به تست سه گانه یا چهارگانه، (Triple Test, Quadruple Test) مشکوک به وجود اختلالات کروموزومی جنین ، وجود نتایج سونوگرافی حین بارداری مشکوک به اختلال کروموزوم در جنین ، داشتن فرزند مبتلا به یک اختلال کروموزومی (زنده یا فوت شده) و وجود اختلالات کروموزومی در خانم باردار یا همسر وی می باشد.

مزایای روش QF-PCR در تشخیص آنیوپلوئیدی

بررسی آنیوپلوئیدی با روش کاریوتایپ به حدود 2 هفته زمان نیاز دارد؛ در حالی که با روش QF-PCR حدود 5-4 ساعت زمان لازم است که مدت زمان بسیار کوتاه تری می باشد. همچنین، نتایج QF-PCR در حدود دو روز کاری بعد از نمونه گیری مایع آمنیوتیک (AF) و یا پرزهای کوریونی جنینی (CVS) مشخص می شود و قابل ارائه به پزشک یا متخصص ژنتیک می باشد تا در مورد سرنوشت بارداری هرچه سریع تر تصمیم گیری شود. از آنجایی که در ایران، اجازه سقط قانونی جنین تا پایان هفته ۱۸ بارداری می باشد بنابراین سرعت بالای آزمایش بسیار مهم است تا فرصت کافی برای سقط جنین وجود داشته باشد. از طرف دیگر دو تا سه هفته انتظار برای آگاهی از نتیجه آزمایش برای مادران باردار طاقت فرسا می باشد. در صورت مراجعه دیر هنگام مادران باردار با توجه به زمان کم تا سقط قانونی تکنیک QF-PCR در مدت زمان کوتاهی جواب آماده می شود و در صورت ابتلای جنین با روش MLPA نیز تایید صورت گرفته و مجوز سقط قانونی با تایید هر دو روش صادر می گردد.
تکنیک QF-PCR، روشی آسان، سریع، قابل اطمینان و مقرون به صرفه در تشخیص آنیوپلوئیدی پیش از تولد می باشد.
روش QF-PCR روش تشخیصی سریع تری می باشد و به کشت سلولی نیاز ندارد و این روش می تواند در مدت کمتر از حدود 3-2 روز کاری بعد از نمونه گیری پرزهای جنینی یا مایع آمنیوتیک، وضعیت آنیوپلوئیدی جنینی را مشخص کند. در حالی که روش کشت سلول و تعیین کاریوتایپ به حدود 14-10 روز زمان نیاز دارد.

روش QF-PCR دارای حساسیت و اختصاصیت بالا می باشد و در نتیجه به مقادیر بسیار کم DNA ژنومی جنین جهت انجام واکنش PCR و تشخیص آنیوپلوئیدی نیاز می باشد. از این رو در کیت تشخیص آنیوپلوئیدی مورد مورد استفاده قرار می گیرد.
پس از غربالگری با روش NIPT، تست QF-PCR امکان تشخیص دقیق و مطمئن وضعیت آنیوپلوئیدی پیش از تولد را فراهم می کند.
این روش دارای حساسیت و اختصاصیت بسیار بالا و دقت (>%99) می باشد و در مواردی که نمونه کمی از مایع آمنیون یا CVS موجود می باشد احتمال به جواب رسیدن بالا می باشد.
روش QF-PCR روش تشخیصی مقرون به صرفه تری می باشد و در مقایسه با هزینه نسبتا بالای آزمایش های کروموزومی پیش از تولد، هزینه این روش، برای متقاضیان کمتر و به صرفه می باشد.
آزمایش QF-PCR را می توان با استفاده از نمونه غیر زنده (مانند جنین سقط شده یا فوت شده بعد از تولد) نیز انجام داد. در حالی که با روش های سیتوژنتیکی نمونه باید فقط از جنین زنده تهیه شود.
کیفیت عملکرد روش QF-PCR به صورتی است که از سن بارداری تأثیرپذیری ندارد و در هر سنی از جنین می توان جهت انجام تست نمونه برداری نمود.

روش انجام تست QF-PCR

نمونه گیری با روش آمنیوسنتز و CVS پس از هفته دوازدهم بارداری
استخراج DNA از مایع آمنیوتیک یا پرزهای کوریونی
تکثیر مارکرها با روش PCR با استفاده از کیت اختصاصی QF-PCR
آنالیز نمونه ها با روش Capillary electrophoresis درون دستگاه Genetic Analyzer
آنالیز نهایی نمونه ها با استفاده از نرم افزار Gene Mapperیا Gene Marker

محدودیت آزمایش QF-PCR

این روش ها قادر به تشخیص میزان پایین موزاییسم و همچنین اختلالات سایر کروموزوم ها غیر از 13، 18، 21، X و Y نمی باشد.
به طور کلی، تکنیک QF-PCR در تشخیص حذف ها مناسب نیست.
در برخی موارد نادر، نمونه های مورد بررسی ممکن است در برخی کروموزوم ها فاقد هرگونه مارکر باشند که در این موارد استفاده از روش های FISH یا کاریوتایپینگ توصیه می گردد.