لگو سایت تریتاژن

تکنیک Real-Time PCR

تکنیک Real-Time PCR چیست؟

تکنیک Real-Time PCR، یکی از رایج ترین تکنیک های مولکولی است که برای کاربرد های مختلف در حوزه های علوم پایه، بیوتکنولوژی، پزشکی، پزشکی قانونی، تشخیص بیماری ‏های عفونی و … استفاده می شود. تشخیص توالی های تکثیر شده در PCR  معمولی نیازمند آنالیز های بعد از واکنش مانند الکتروفورز ژل آگارز است؛ در حالی که در تکنیک  Real-Time PCR، امکان تشخیص قطعات تکثیر شده در لحظه و در حین وقوع واکنش ممکن می باشد.

با ظهور تکنیک Real-Time PCR و انواع مختلف آن مانند Real-Time Reverse Transcription PCR ( Real-Time RT-PCR) امکان بررسی بیان ژن ها فراهم شد. در این روش، تکثیر قطعات و تشخیص به طور همزمان در یک مرحله قابل انجام است که علت آن استفاده از ترکیبات فلورسنت در واکنش می باشد. این ملکلول های فلورسنت افزایش میزان DNA تکثیر شده را از طریق افزایش سیگنال فلورسنت گزارش می دهند. این سیگنال توسط دستگاه قابل اندازه گیری و ثبت بوده و به صورت نمودارهایی نمایش داده می شود.

دو استراتژی برای به کارگیری مولکول های فلورسنت در واکنش Real-Time PCR وجود دارد؛ این استراتژی ها شامل استفاده از مولکول های فلورسنت متصل شونده به DNA مانند سایبرگرین و استفاده از توالی های نشاندار شده با مولکول های فلورسنت مانند پرایمر ها و پروب ها می ‌باشد. هر دو استراتژی به طور موازی توسعه یافتند و در تشخیص پاتوژن ها استفاده می شوند اما از آنجایی که پرایمر ها و پروب های نشاندار به صورت اختصاصی توالی هدف را تشخیص می دهند، استفاده از آن ها ارجحیت دارد.

سیگنال فلورسنت ثبت شده در دستگاه متناسب با میزان محصول تکثیر شده در هر چرخه از واکنش است. مهم ترین مزیت Real-Time PCR  نسبت به PCR معمولی تعیین تعداد نسخه اولیه توالی الگو است. به طوری که مقدار نمونه مورد نیاز جهت انجام واکنش می تواند بسیار کم باشد.به طور کلی، Real-Time PCR می تواند به دو صورت کیفی (حضور یا عدم حضور توالی مورد نظر) و کمی (تعداد نسخه  DNA) باشد. که واکنش کمی Real-Time PCR به عنوان qPCR شناخته می شود.

با افزایش اطلاعات مربوط به توالی یابی ژنوم موجودات زنده امکان طراحی واکنش Real-Time PCR برای تشخیص هر میکروارگانیزمی امکان پذیر است. استفاده از این روش باعث تشخیص دقیق و سریع و کمی سازی توالی هدف در ماتریس های متفاوت می شود؛ هم زمان بودن تکثیر و مشاهده نتیجه باعث کاهش زمان انجام واکنش شده و همچنین به دلیل عدم نیاز به اقدامات پس از تکثیر احتمال آلودگی های متقاطع در این روش بسیار کم است. از آنجايي که تمامي مراحل واکنش Real-Time PCR در داخل يک لوله دربسته انجام مي شود، خطر ايجاد آلودگي در آن در مقايسه با PCR معمولي بسيار کاهش يافته و در نتيجه از حصول نتايج مثبت کاذب جلوگيري مي شود. تکنیک qPCR در تشخیص پاتوژن ها، در مطالعات بیان ژن ها به وسیله بررسی RNA  با روش RT-qPCR ، بررسی تمایز آللی، تعیین تایپ سویه ها، بررسی ارگارنیزم هایی که از نظر ژنتیکی تغییر یافته اند، تعیین مقاوت به آنتی بیوتیک، تولید توکسین و … نیز کاربرد دارد.

 

فازهای مختلف واکنش در تکنیک Real-Time PCR

به طور کلی، می توان واکنش Real-Time PCR را به چهار فاز تقسیم کرد که شامل موارد زیر می باشد:

  • فاز خطی (Linear ground phase)

در ابتدای اجرای واکنش PCR، مقدار محصول بسیار کم می باشد، که نشان دهنده فلورسنت بسیار کمی است. در این مرحله تکثیر قطعات به تازگی آغاز می گردد. در طول این مدت، واکنش در حال تثبیت بوده و ممکن است پیک های کوچکی در منحنی وجود داشته باشد که به عنوان “نویز” (noise) یا سیگنال پس زمینه (background signal) شناخته می شود. این مرحله از واکنش معمولا بین سیکل های 1 تا 15 رخ داده و به عنوان Linear ground phase شناخته می شود.

  • فاز نمایی اولیه (Early exponential phase)

در این فاز تکثیر به شکل تصاعدی انجام شده و دستگاه سیگنال ها را دریافت می کند.

  • فاز لگاریتمی یا نمایی (log-linear or exponential phase)

در این فاز به تدریج سرعت واکنش Real-Time PCR به تدریج کاهش یافته و مواد واکنش و کارایی آنها در حالت کاهش می باشد.

  • فاز پلاتو (plateau phase)

در فاز چهارم دیگر تغییری در سطح نور فلورسنت دریافتی توسط دستگاه تشخیص داده نمی شود که نشان دهنده از بین رفتن ترکیبات موجود در واکنش می باشد.

پس از اتمام تکثیر محصولات PCR، تجمع سیگنال های فلورسنت که در طول واکنش رخ داده است با یک مقدار چرخه آستانه (Cycle Threshold) یا به اختصار Ct  برای تعیین نتایج اندازه گیری می شود.  مقدار چرخه آستانه(Ct)  یک واکنش به عنوان شماره ی سیکلی که میزان فلورسنت یک محصول PCR در بالای سیگنال پس زمینه تشخیص داده می شود، تعریف می گردد. مقدار Ct با مقدار محصول PCR در واکنش مرتبط می باشد. به طوری که هر چه مقدار Ct کمتر باشد، محصول PCR بیشتری وجود دارد. علت این امر آن است که تعداد بالای نمونه اولیه نیاز به تعداد سیکل های PCR کمتری دارد تا آن محصول از طریق سیگنال پس زمینه شناسایی گردد.به عنوان مثال زمانی که Ct واکنش کمتر از 29 است، نشان دهنده وجود مقادیر بالایی از نمونه می باشد. در صورتی که Ct بین 30 تا 37 باشد، مقدار نمونه متوسط و Ct بین 38 تا 40 بیانگر حداقل مقادیر اسید نوکلئیک هدف خواهد بود.

انواع رنگ های فلورسنت و پروب های مورد استفاده در Real-Time PCR

در تکنیک Real-Time PCR به طور کلی از دو گروه رنگ های فلورسنت استفاده می شود که در گروه اول رنگ های فلورسنت متصل شونده به DNA دو رشته ای مانند سایبرگرین (SYBR Green) و اواگرین (EvaGreen) استفاده می شود که به هر DNA دو رشته ای در محیط واکنش به شکل غیر اختصاصی متصل می شوند. در گروه دوم رنگ های فلورسنت به توالی های الیگونوکلئوتیدی به نام پروب متصل هستند بنابراین تنها می توانند به توالی های خاصی متصل شوند که شامل پروب های هیدورلیزی مانند پروب TaqMan و beacons می باشد.

·  سایبرگرین و اواگرین

این دسته از رنگ ها فلورسنت بسیار متداول هستند و به طور گسترده در تست ها مورد استفاده قرار می گیرند. SYBR® Green  هنگامی که در محلول آزاد است فلورسنت کمی از خود نشان می دهد، اما هنگامی که به dsDNA متصل می شود سیگنال فلورسنت آن تا 1000 برابر افزایش خواهد یافت. بنابراین، سیگنال فلورسنت کلی از یک واکنش متناسب با مقدار dsDNA موجود است و با تکثیر توالی هدف و تجمع بیشتر محصولات PCR ، شدت سیگنال دریافتی توسط دستگاه افزایش می‌ یابد.

رنگ های متصل شونده به DNA (DNA-binding dyes) را می توان به دو دسته غیر اشباع شونده (nonsaturating) یا اشباع شونده (saturating) طبقه بندی کرد. رنگ های اشباع شونده مانند SYBR® Green  هنگامی که بالاتر از غلظت معینی استفاده می شوند، باعث مهار واکنش های PCR خواهند شد. لز سوی دیگر، رنگ ‌های غیر اشباع شونده مانند EvaGreen واکنش PCR را مهار نکرده و می ‌توانند در غلظت کافی استفاده شوند تا تمام محل ‌های اتصال خالی روی dsDNA توسط این نوع رنگ پوشیده گردد. با این حال، رنگ های اشباع برای استفاده در high resolution melt assays به دلیل تغییر سیگنال گسسته تر مشاهده شده پس از دناتوره شدن DNA بیشتر مورد استفاده قرار می گیرند.

از مزایای استفاده از رنگ ‌های متصل شونده به dsDNA می توان به موارد زیر اشاره کرد که عبارتند از:

  • طراحی ساده پرایمر: فقط دو پرایمر DNA خاص برای توالی مورد نیاز است، بنابراین طراحی پروب ضروری نمی باشد.
  • توانایی آزمایش سریع چندین ژن بدون نیاز به پروب‌های متعدد
  • هزینه کمتر
  • توانایی انجام تجزیه و تحلیل منحنی ذوب (melt curve) برای بررسی فرآیند تکثیر قطعات

·  پروب های TaqMan و beacons

این دسته از رنگ های فلورسنت به شکل متصل به پروب مورد استفاده قرار می گیرند. سنجش هیدرولیز TaqMan شامل یک پروب الیگونوکلئوتیدی نشاندار شده با فلورسنت خاص توالی و همچنین پرایمر PCR اختصاصی توالی می باشد. در سنجش هیدرولیز از فعالیت اگزونوکلئاز 5’→ 3′ از برخی پلیمراز های مقاوم در برابر حرارت مانند Taq polymerase استفاده می گردد. پروب های TaqMan با یک reporter فلورسنت در انتهای 5′ و یک خاموش کننده یا Quencher در انتهای 3′ برچسب گذاری (labeled ) می شوند.

هنگامی که پروب دست نخورده و سالم است، سیگنال فلورسنت Reporter به دلیل نزدیکی آن به Quencher خاموش می شود. اما زمانی که پروب به توالی هدف متصل شده و فرآیند تکثیر قطعه آغاز می شود،Reporter با فعالیت اگزونوکلئازی 5’→ 3′  آنزیم Taq pol از Quencher جدا شده و سیگنال های متناسب با میزان تکثیر محصول PCR توسط دستگاه ثبت می گردد.

از مزایای اصلی استفاده از این دسته پروب ها می توان به اختصاصیت (specificity) بالا، نسبت سیگنال به نویز بالا و توانایی انجام واکنش های چندگانه اشاره کرد. از سوی دیگر، از معایب این روش می توان به هزینه اولیه پروب (که ممکن است بالا باشد) اشاره کرد.

از سوی دیگر، پروب هایbeacon  به صورت یک توالی 25 تا 40 نوکلئوتیدی است که ساختاری سنجاق سری (Hair pin) تشکیل می دهد. انتهای 5′ و 3′ این پروب دارای توالی های مکمل 5-6 نوکلئوتید است که ساختار ساقه را تشکیل می دهند. بخش لوپ این پروب ها به گونه ای طراحی می شود که با یک توالی 15 تا 30 نوکلئوتیدی از توالی هدف مکمل باشد. در طراحی این پروب ها یک مولکول فلورسنت Reporter در انتهای 5′ و یک Quencher در انتهای 3′ آن قرار می گیرد. بنابراین با تشکیل ساختار سنجاق سری، Reporter و Quencher به هم نزدیک شده و هیچ سیگنال فلورسنتی منتشر نمی گردد.

 

کاربرد های روش  Real-Time PCR در تشخیص عفونت ها

تشخیص بسیاری از بیماری های عفونی با روش های تشخیصی کلاسیک مانند کشت و ایمونواسی امکان پذیر نیست، امروزه تکنیک Real-Time PCR جایگزین این روش ها شده است. این تکنیک با تشخیص مستقیم DNA یا RNA پاتوژن ها امکان تشخیص سریع و بسیار دقیق بیماری‏ های عفونی را فراهم می‏کند و در سال هاي اخير به عنوان روشي جهت تشخيص بسياري از بيماري هاي عفوني در آزمايشگاه ها مورد استفاده قرار گرفته است. در تشخیص و کمی سازی پاتوژن ها (ویروس ‏ها، باکتری ها و عوامل انگلی) باید عواملی مثل هدف تشخیص DNA یا RNA ، قابلیت کشت شدن میکروارگانیزم، اهمیت بالینی و تفسیر نتایج حاصل از واکنش توجه کرد. از آنجایی که کشت ویروس های بالینی پاتوژن زمان بر یا ناممکن است و تست الیزا نیز حساسیت و اختصاصیت نسبتا کمی دارد، تکنیک qPCR نقش مهمی در تشخیص، کمی سازی و تعیین تایپ این پاتوژن ها دارند.

·  تشخیص بیماری های ویروسی

ویروس ها عوامل عفونت زایی هستند که فقط درون سلول های زنده قادر به تکثیر بوده و می توانند باعث ایجاد عفونت در تمام ارگانیزم ها شامل گیاهان، جانوران و میکروارگانیزم ها شوند. ویروس ها بر اساس نوع ژنوم DNA یا RNA ، تک رشته یا دو رشته بودن ژنوم و نحوه همانند سازی طبقه بندی می گردند. همانطور که گفته شد ویروس ها فقط درون سلول های زنده توانایی رشد و تکثیر دارند. بنابراین عفونت زایی ویروس ها پس از ورود به بدن میزان و نفوذ به درون سلول های آن اتفاق می افتد. بعضی از ویروس ها باعث اثرات سایتوپاتیک و در بعضی موارد مرگ سلول می شوند؛ بعضی از ویروس ها نیز به صورت خفته و غیرفعال درون سلول می مانند. در بعضی موارد ویروس هایی مانند پاپیلوما ویروس و Epstein-Barr Virus باعث سرطانی شدن سلول میزبان می شوند.

ژنوم بسیاری از ویروس های پاتوژن مانند HIV، COVID-19 و … از جنس RNA می باشد که به منظور تشخیص آنها ابتدا RNA  استخراج شده از ویروس توسط آنزیم Reverse Transcriptase به cDNA تبدیل شده و سپس واکنش qPCR ادامه می یابد. این روش RT-qPCR نام دارد که علاوه بر تشخیص RNA ویروس ها در مطالعات بیان ژن هم کاربرد دارد. تشخیص انگل های تک سلولی با روش مرسوم میکروسکوپی نیز روشی زمان بر، پرزحمت و نیازمند نیرو های آموزش دیده است، بنابراین تکنیک Real-Time PCR ابزار قدرتمندی در تشخیص، کمی سازی و تعیین تایپ تک سلولی های انگلی می باشد.

به طور کلی تشخیص ویروس های بیماری زا در انسان با چندین روش امکان پذیر است که شامل سرولوژی، تشخیص ویروس-آنتی ژن، کشت ویروس و تکثیر ژنوم ویروسی می باشد. در سال های اخیر روش Real-Time PCR به دلیل دقت بالا در تشخیص DNA/RNA  و قابلیت کمی سازی به طور گسترده در تشخیص عفونت های ویروسی مورد استفاده قرار گرفته است. با وجود اینکه کشت ویروسی به عنوان استاندارد طلایی تشخیص ویروس های کشت پذیر مانند آدنوویروس ها، سایتومگالوویروس، هرپس، آنفولانزا و… مطرح است اما تایید نتایج آن به بیش از 5 الی 9 روز زمان نیازمند است. از سوی دیگر، با این روش تعیین ژنوتایپ ویروسی امکان پذیر نیست.

·  تشخیص باکتری ها

برخلاف ویروس ها و انگل ها، بسیاری از باکتری ها قابل کشت هستند. به همین دلیل کشت دادن روش اصلی تشخیص این پاتوژن ها محسوب می شود. با این حال در موارد بحرانی روش سنتی، روشی زمان بر و چند مرحله ای است و نمی تواند نتایج را در زمان مناسب فراهم کند؛ در این موارد نیز Real-Time PCR می تواند در مدت زمان کوتاه تری نتایج دقیق را فراهم کند اما ویژگی های فنوتایپی و بیوشیمیایی باکتری باید درنظر گرفته شود.

 

منابع علمی

https://www.future-science.com/doi/10.2144/05391RV01

https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2105-7-85

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2017.00108/full

https://www.bio-rad.com/en-ca/applications-technologies/introduction-pcr-primer-probe-chemistries?ID=LUSOJW3Q3