آنتی ژن لکوسیت انسانی

آنتی ژن لکوسیت انسانی HLA چیست؟ تعیین آنتی ژن لکوسیت انسانی HLA typing

آنتی ژن لکوسیت انسانی (HLA) چیست؟

مولکول های HLA، گلیکوپروتئین های سطح سلولی هستند که وظیفه اصلی آنها ارائه آنتی ژن های اندوژن (endogenous) و اگزوژن (exogenous) به لنفوسیت های T برای شناسایی و بروز پاسخ ایمنی است. آنتی ژن لکوسیت انسانی (human leukocyte antigen)یا به اختصار HLA، که معمولاً به عنوان مجتمع اصلی سازگاری بافتی (MHC) نامیده می شوند، تقریبا در تمام مهره داران فک دار (jawed vertebrates) یافت می گردد. موقعیت ژن کد کننده HLA در بازوی کوتاه کروموزوم 6 (6p21) است که در آن ناحیه بیش از 200 ژن کد کننده پروتئین وجود دارد.

هر فرد دارای HLA مختص به خود بوده و هیچ دو انسانی HLA یکسان ندارد (به جز دوقلو های همسان). بنابراین می توان گفت HLA نوعی مارکر شناسایی سلول های انسانی می باشد. محصولات یا پروتئین هایی که توسط ژن HLA بیان می گردند، روی سطح سلول قرار گرفته و نقش مهمی در ارائه آنتی ژن و سیگنال دهی به سیستم ایمنی دارد. ناحیه HLA به شدت پلی‌مورفیک است و پلی‌مورفیسم ‌های موجود در مولکول ‌های HLA منجر به تنوع در توالی ‌های اسید آمینه مولکول ‌های HLA شده و بر ویژگی اتصال پپتید تأثیر می‌گذارد. این پلی مورفیسم ها عملکرد های مختلفی مانند ایجاد تنوع ژنتیکی در افراد و تفاوت انسان ها در میزان بروز بیماری ها دارد.

به طور کلی، در HLA سه منطقه مختلف مشاهده می شود که عبارتند از:

HLA کلاس I

ژن‌های کلاس I شلمل HLA-A، HLA-B و HLA-C هستند که تقریباً در تمام سطوح سلول‌ های هسته ‌دار (nucleated cell) با بالاترین تراکم در سطح لنفوسیت توزیع شده اند. این ژن ها اغلب آنتی ژن CD8+ سلول های T را کد می کنند.

HLA کلاس II

ژن های HLA کلاس II شامل خانواده HLA-D، عمدتا HLA-DP، HLA-DQ، و HLA-DR هستند که اغلب بر روی سطح سلول های تخصصی ارائه دهنده آنتی ژن مانند لنفوسیت های B، ماکروفاژها و سلول های دندریتیک توزیع می شوند. این ژن ها اغلب آنتی ژن CD4+ سلول های T را کد می کنند.

HLA کلاس III

ژن های این گروهه تقریباً تقریبا متشکل از 75 ژن است که اکثر آنها عملکرد نا شناخته ای دارند. ژن های این کلاس کد کننده سیستم کمپلمان (complement system)، ۲۱ هیدروکسیلاز، پروتئین شوک حرارتی (heat shock protein) و فاکتورهای نکروز تومور (tumor necrosis factors) می باشند.

نتایج مطالعات مختلف نشان می دهند که بروز تغییرات ژنتیکی در لوکوس کد کننده ژن های HLA با بروز حساسیت یا مقاومت در برابر ابتلا به بیماری های عفونی مرتبط است. به عنوان مثال در برخی بررسی های ژنتیکی، ارتباط بین آلل ها یا هاپلوتیپ های HLA و بروز بیماری های عفونی باکتریایی از جمله سل (tuberculosis)، جذام (leprosy) و ملیوئیدوز (melioidosis) و عفونت های ویروسی مانند HIV مشخص شده است. بنابراین با توجه به اینکه بیماران با HLA های مختلف، پاسخ ایمنی متفاوتی به عفونت های باکتریایی و ویروس نشان می دهند، تعیین نوع HLA (HLA Typing) می تواند اهمیت بسیار بالایی در بررسی خطر ابتلا به بیماری ها و مشخص کردن پاسخ های سیستم ایمنی (به عنوان مثال در زمان پیوند عضو) داشته باشد.

ساختار و عملکرد HLA

سیستم HLA روی بازوی کوتاه کروموزوم 6 با موقعیت 6p21 قرار گرفته است و محدوده به طول 4000 kb از ژنوم را در بر می گیرد. مولکول های HLA کلاس I به صورت گلیکوپروتئین های ترانس ممبران (transmembrane) یا گذرنده از غشا هستند که روی سطح تمام سلول های هسته دار مشاهده می شوند. عملکرد این مولکول ها به صورت ارائه آنتی ژن های خودی یا غیر خودی به رسپتورهای سلول های T سیتوتوکسیک CD8+ و رسپتور های killer cell immunoglobulin-like (KIR) می باشد. مولکول های کلاس I HLA از دو زنجیره پلی پپتیدی هترودایمر که شامل یک زنجیره α سنگین و یک زنجیره β2-microglobulin سبک تر تشکیل شده اند. زنجیره α از سه دومین (Domain) خارج سلولی به نام های α1، α2 و α3، یک دومین ترانس ممبران و یک دم سیتوپلاسمی c-terminal تشکیل شده است. دومین های α1 و α2 با تاخوردگی (folding) یک شیار متصل شونده به پپتید (peptide-binding groove) را ایجاد می کنند که به عنوان recognition region شناخته می شود. β2-microglobulin با α3 در پایداری HLA نقش مهمی را ایفا می کنند.

مولکول ‌های HLA کلاس II روی سطح سلول‌ های antigen-presenting cells یا به اختصار APC مانند ماکروفاژها، سلول ‌های B و سلول‌ های دندریتیک (dendritic cells) قرار دارند. این کلاس از HLA ها، پپتیدهای آنتی ‌ژنی کوتاهی را به CD4+ helper T cells و گیرنده ‌های آن ‌ها ارائه می ‌دهند. در ساختار مولکول‌ های HLA کلاس II دو زنجیره پلی ‌پپتیدیبه صورت یک زنجیره α و یک β مشاهده می شود. هر زنجیره به ترتیب به دو دومین مجزا تا می خورد که شامل α1 و α2 و همچنین β1 و β2 است. سپس یک شیار متصل شونده به پپتید توسط دومین های α1 و β1 دیستال تشکیل می گردد. دومین های پروگسیمال، α2 و β2، به شدت محافظت شده بوده و T cell receptor به آن متصل خواهد شد.

HLA کلاس III ناحیه 700 kb از DNA را در برگرفته و بین منطقه سانترومری کلاس II با نام HLA-DRA و همچنین منطفه تلومری کلاس I با نام MICB قرار دارد.

تعیین نوع HLA (HLA Typing)

به طور کلی، تعیین نوع HLA یا HLA typing در افراد و بیماران می تواند آلل های مرتبط با خطر بروز بیماری ها را شناسایی کرده و بازدهی درمان را افزایش دهد. امروزه HLA typing در زمینه پیوند عضو یا ذخیره خون بند ناف از اهمینپت بالایی برخوردار است. به عنوان مثال در بیمارانی که نیازمند دریافت عضو پیوندی هستند، تست HLA typing به منظور بررسی سازگاری بافتی بین فرد اهدا کننده و دریافت کننده انجام می شود تا خطر رد پیوند به حداقل کاهش یابد.

در حال حاضر، تکنیک های مولکولی مختلفی نظیر PCR در زمینه تعیین HLA مورد استفاده قرار می گیرند که بسته به قدرت آن ‌ها در تمایز بین آلل ‌های HLA به دو گروه با وضوح پایین و وضوح بالا طبقه بندی می شوند. از پرکاربردترین روش های مبتنی بر DNA در ارتباط با PCR برای تایپ HLA می توان به پروب الیگونوکلئوتیدی اختصاصی توالی (sequence-specific oligonucleotides probe) یا به اختصار SSO و پرایمر های اختصاصی توالی (sequence-specific primers) یا SSP اشاره کرد. در ادامه به معرفی این روش های پرداخته می شود.

پرایمر اختصاصی توالی (SSP)

تکنیک PCR-SSP یک تکنیک قدرتمند در تشخیص SNP در آلل هاست که دارای تفاوت های تک نوکلئوتیدی در توالی خود هستند. روش SSP نخستین بار در سال 1990 و بر اساس روش ARMS (amplification of refractory mutation systems) ایجاد شد. اساس این روش استفاده از پرایمری است که به طور کامل منطبق با یک توالی خاص در DNA بوده و با PCR تکثیر می گردد. اختصاصیت (specificity) این روش از طریق استفاده از پرایمرهای مختص توالی که دارای یک عدم انطباق تک نوکلئوتیدی در ناحیه 3′ خود هستند، مشخص می شود. وجود 3′ single-base mismatch در این دسته از پرایمرها مانع از انجام تکثیر غیر اختصاصی خواهد شد. با توجه به اینکه آنزیم Taq polymerase فاقد فعالیت 3′ به 5′ اگزونوکلئازی است نمی تواند این پرایمرها را به درستی تکثیر کرده و تنها آلل هایی که دارای تطابق کامل هستند تکثیر می شوند.

پروب الیگونوکلئوتیدی اختصاصی توالی (SSOP)

تکنیک PCR-SSOP نسبت به PCR-SSP برای typing HLA با کارایی بالا سازگارتر است. این تکنیک در بررسی سازگاری های بافتی در بیماران نیازمند پیوند مغز استخون و افراد اهدا کننده مورد استفاده قرار می گیرد. علاوه براین، این تکنیک در تعیین و شناسایی وجود SNPs ها در توالی ژنوم نیز به کار می رود.

در این روش ابتدا لوکوس HLA توسط پرایمرهای SSO نشان دار شده با بیوتین تکثیر می شوند. سپس در مرحله بعد محصولات PCR با یک غشای strips که دارای پروب های SSO مختص آلل های خاصی است هیبرید می گردد. سپس نتایج واکنش با استرپتاویدین کونژوگه به پراکسیداز آشکار می شود. در این تکنیک SNPs ها در حین طراحی پروب دورن توالی آن قرار می گیرند نه در انتهای 3′. بنابراین این یک فرآیند هیبریداسیون وابسته به دما برای تعیین اینکه آیا یک پروب به یک آمپلیکون متصل می شود یا خیر خواهد بود.

سیستم HLA و پیوند عضو

از دیر باز آنتی ژن های HLA-A، HLA-B و HLA-DR به عنوان اصلی ترین موارد در زمینه پیوند عضو شناخته شده هستند. داده‌های بالینی اخیر نشان می ‌دهند که تطابق HLA-C بر نتایج بالینی پیوند سلول ‌های بنیادی خونساز نیز تأثیر می‌ گذارد اما HLA-DQ و HLA-DP خیلی حیاتی به نظر نمی‌ رسند. پاسخ های ایمنی یا تولید آنتی بادی توسط هر دو نوع سلول B و T در رد عضو پیوندی از اهمیت بالایی برخوردارند. لنفوسیت های T قادرند پپتید های سلول های گیرنده که مرتبط با HLA فرد دهند هستند را شناسایی کنند.

سلول های T کمکی CD4+ توسط سلول های APC که دارای آنتی ژن های کلاس II هستند، فعال می شوند. به طور کلی، سلول های APC چه از فرد دهنده باشند و چه گیرنده، منجر به فعال شدن سلول های T گیرنده خواهند شد. APC هایی که در بافت پیوندی قرار دارند، عامل فعال شدن مستقیم سلول های T کمکی در فرد گیرنده می گردند. بنابراین شناسایی مستقیم آنتی ژن ها توسط سلول های T کمکی نقش مهمی در رد پیوند ایفا می کند.

آنتی بادی هایی که به HLA های عضو پیوندی متصل می شوند باعث آسیب به اندوتلیوم عروقی و در نتیجه ترومبوز، تجمع پلاکت ها و خونریزی خواهند شد. آنتی بادی های طبیعی علیه گروه خونی ABO و آنتی بادی های از پیش ساخته شده HLA باعث رد بیش از حد حاد (hyperacute rejection ) عضو پیوندی می گردند. علت hyperacute rejection آنتی بادی های طبیعی ضد A و آنتی B این است که آنتی ژن های AB بر روی سلول های اندوتلیال پیوند بیان می شوند. آلوایمونیزاسیون HLA (HLA alloimmunization) می تواند با تزریق خون، حاملگی یا پیوند ایجاد گردد. رد حاد عضو پیوندی در درجه اول نتیجه پاسخ سلول های T است.

ارتباط آنتی ژن لکوسیت انسانی با بیماری های خود ایمنی

امروزه با پیشرفت در زمینه تکنیک ‌های مولکولی، می توان بر اساس توالی ژنتیکی و ترکیب اپی توپ‌ های مختلف مولکول ‌های HLA و ژن‌ هایی که آنها را رمزگذاری می ‌کنند، ارتباط بین انواع مارکر HLA و پاتوفیزیولوژی بیماری های خود ایمنی را مشخص کرد. از جمله بیماری های خود ایمنی مرتبط با HLA می توان به مواردی از جمله آرتریت روماتوئید (RA)، لوپوس اریتماتوز سیستمیک (SLE)، مالتیپل اسکلروزیس (MS)و … اشاره کرد.

·آرتریت روماتوئید (RA)

آرتریت روماتوئید از جمله بیماری های خود ایمنی (Ads) است که منجر به التهاب مفاصل خواهد شد. نتایج تحقیقات مختلف نشان داده اند که ژن های HLA مختلفی در بروز حساسیت به RA نقش دارند که شامل HLA-DRB1*04:01 ، HLA-DRB1*04:04، HLA-DRB1*04:08 در قفقازی ها، HLA-DRB1*04:05 در اسپانیایی ها و ژاپنی ها، HLA-DRB1*01:01 و HLA-DRB1*01:02 در اسرائیلی ها و HLA-DRB1*14:02 در برخی بومیان آمریکا است.

·مالتیپل اسکلروزیس (MS)

مالتیپل اسکلروزیس یا بیماری ام اس (MS)، یکی از بیماری های خود ایمنی است که از طریق پاسخ سلولی ایمنی غالب با حضور autoreactive T cells که در برابر پروتئین پایه میلین (MBP)، گلیکوپروتئین الیگودندروسیت میلین (MOG) و پروتئین پروتئولیپید (PLP) واکنش نشان می دهند، مشخص می گردد. آلل های HLA-DRB1*15:01 و HLA-DQB1*06:02 ، آلل های اصلی مرتبط با خطر ابتلا به ام اس در قفقازی ها و آمریکایی های لاتین هستند.

·لوپوس اریتماتوز سیستمیک (SLE)

بیماری لوپوس اریتماتوز سیستمیک یا به اختصار بیماری لوپوس، نوعی بیماری خودایمنی است که در آن بافت پیوندی و اندام های مختلفی مانند پوست و کلیه تحت تاثیر قرار می گیرند. ارتباط بین HLA و بیماری SLE نسبت به سایر بیماری های خودایمنی قوی تر می باشد. نتایج مطالعاتی که HLA کلاس II را مورد ارزیابی قرار داده اند، نقش آلل ‌های HLA-DR2 (DRB1*15:01)، HLA-DR3 (DRB1*03:01)، HLA-DRB1*08:01 و HLA-DQA1*01:02 مرتبط با این بیماری در جمعیت های آمریکایی و اروپایی را گزارش کرده اند.

آزمایش بررسی آنتی ژن لکوسیت انسانی

آزمایش HLA یا آزمایش آنتی ژن لکوسیت انسانی، نوعی آزمایش خون است که جهت شناسایی و تعیین نوع آنتی ژن های سطح سلول های هر فرد انجام می شود. علت انجام آزمایش HLA این است که مارکرهای HLA روی سطح سلول ها به سیستم ایمنی کمک می کنند تا سلول های خودی را از غیر خودی تشخیص داده و پاسخ مناسب را ارائه دهد. تست HLA یکی از آزمایشات مهم در انجام عمل پیوند مانند پیوند کلیه، مغز استخوان یا استفاده از سلول های بنیادی خون بندناف است که به منظور تطبیق گیرنده پیوند (فردی که پیوند دریافت می کند) با اهداکننده سازگار (فردی که سلول های خود را برای پیوند می دهد) استفاده می شود.

سلول های بنیادی پیوندی باید تا حد امکان با گیرنده مطابقت داشته باشند. هر چه تعداد آنتی ژن های منطبق بیشتر باشد، احتمال موفقیت پیوند بیشتر می شود. علاوه بر این، یک تطبیق خوب همچنین خطر عوارض بعد از پیوند مانند رد عضو را کاهش می دهد. اکثر موارد انطباق و شباهت بالای مارکر HLA در تست HLA بین اعضای خانواده مشاهده می گردد. بنابراین جستجوی اهدا کننده از اعضای خانواده مانند برادر یا خواهر آغاز خواهد شد. تست HLA انواع مختلفی دارد که با توجه به نوع بیماری و پیوند عضو برای بیمار تجویز می گردد.