کاپیلاری الکتروفورز

تکنیک Capillary Electrophoresis

تکنیک کاپیلاری الکتروفورز (Capillary Electrophoresis) چیست؟

تکنیک کاپیلاری الکتروفورز (Capillary Electrophoresis) یا روش CE، نوعی روش جهت جداسازی مواد بر اساس تحرک الکتروفورتیک است که در آن حرکت یون ها تحت تأثیر جریان الکتریسیته به تفکیک اجزا کمک می کند. تحرک الکتروفورتیک به بار مولکول، ویسکوزیته (viscosity) و شعاع اتم بستگی دارد. سرعت حرکت ذره به طور مستقیم با میدان الکتریکی اعمال شده متناسب است، به طوری که هر چه قدرت میدان بیشتر باشد، تحرک سریع تر خواهد بود. از سوی دیگر، گونه های خنثی تحت تأثیر قرار نگرفته و فقط یون ها با بار الکتریکی درون میدان حرکت خواهند کرد. در صورتی که اندازه دو یون یکسان باشد، یونی که بار بیشتری دارد سریع ‌ترین حرکت را انجام می ‌دهد. برای یون هایی با بار یکسان، ذره کوچکتر اصطکاک کمتری دارد و به طور کلی سرعت حرکت سریعتری خواهد داشت. به دلیل کارایی بالا، انتخاب پذیری، وضوح و حساسیت، CE در سال های اخیر به عنوان روشی برای تجزیه و تحلیل مخلوط های پیچیده مولکول ها، محبوبیت فزاینده ای پیدا کرده است که منجر به پیشرفت های متعددی شده و به طور قابل توجهی بر این زمینه تأثیر گذاشت.

انواع تکنیک کاپیلاری الکتروفورز

تکنیک کاپیلاری الکتروفورز دارای انواع مختلفی است که در ادامه به معرفی آنها پرداخته می شود.

Capillary zone electrophoresis (CZE)

در این نوع کاپیلاری الکتروفورز جهت جداسازی به تنها یک کاپیلاری به همراه یک بافر بدون هیچ گونه محیط anticonvective نیاز می باشد. آنالیت ها به نوارهایی تقسیم می شوند که سرعت آنها به جریان الکتروفورتیک و جریان الکترواسموتیک بستگی دارد. جریان الکترواسموتیک به سمت کاتد حرکت کرده و هنگامی که قطبیت معکوس شد، آنالیت هایی با تحرک الکترواسموتیک بالاتر از نیروی الکترواسموتیک از خروجی عبور می کنند. کاپیلاری های پوشش داده شده به افزایش ظرفیت جداسازی موادی که به سطوح سیلیس ذوب شده می چسبند کمک می کند.

Capillary gel electrophoresis (CGE)

در تکنیک ژل کاپیلاری الکتروفورز، جداسازی در یک کاپیلاری مملوء از ژل انجام شده که به عنوان یک غربالگری مولکولی کاملاً شبیه به ژل الکتروفورز عمل می کند. در این نوع تکنیک مولکول ها بر اساس اندازه مولکولی جدا می شوند. به این صورت که مولکول های کوچکتر آزادانه تر در خطول ژل حرکت خواهند کرد. از این رو این مولکول‌ ها سریع ‌تر از مولکول‌ های بزرگتر مهاجرت می‌ کنند. به طور کلی، از کاربردهای ژل کاپیلاری الکتروفورز می توان به قدرت جداسازی پروتئین ها، قطعات DNA و سایر ماکرومولکول های بیولوژیکی با نسبت بار به جرم مشابه بر اساس اندازه مولکولی آنها اشاره کرد.

Micellar electrokinetic capillary chromatography (MEKC)

در تکنیک MEKC، جداسازی در محلول الکترولیتی که از یک سورفکتانت با غلظت بالاتر از غلظت بحرانی میسلی (CMC) تشکیل شده است، رخ می دهد. این تکنیک ترکیبی از الکتروفورز و کروماتوگرافی است که برای هر دو املاح خنثی و باردار قابل استفاده می باشد. مولکول های املاح بین فاز شبه ایستا (pseudo-stationary phase) متشکل از میسل ها و بافر آبی بر اساس ضریب تقسیم املاح توزیع می گردند. سورفکتانت متداول مورد استفاده در MKEC سدیم دودسیل سولفات، ستیل تری متیل و نمک های آمونیوم است. در pH خنثی و قلیایی، جریان الکترواسموتیک قوی بوده و یون های بافر جداسازی به سمت جهت کاتد حرکت می کنند. در صورتی که از سدیم دودسیل سولفات (SDS) به عنوان سورفکتانت استفاده شود، مهاجرت الکتروفورتیک میسل آنیونی به ترتیب آند است و سرعت کلی مهاجرت میسل را در جریان حجمی محلول الکترولیتی کاهش می دهد.

Capillary electrochromatography (CEC)

کاپیلاری الکتروکروماتوگرافی یا CEC، یک تکنیک جداسازی ترکیبی است که از اصول کاپیلاری الکتروفورز و کروماتوگرافی، به ویژه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) در آن استفاده می گردد. در این تکنیک آنالیت ها بر اساس تفاوت در نسبت تقسیم بین فاز متحرک و ثابت یا به دلیل تحرک الکتروفورتیک جدا می شوند. فاز متحرک در سراسر بستر کروماتوگرافی با کمک نیروی الکترواسموتیک به جای فشار اجرا می شود. CEC مزیت بیشتری نسبت به HPLC و تکنیک کاپیلاری الکتروفورز دارد. از کاربردهای این تکنیک می توان به قابلیت جداسازی انانتیومر، جداسازی اسید های آمینه، پروتئین ها، پپتید ها و کربوهیدرات ها اشاره کرد. به طور کلی، CRC عمدتاً در صنایع داروسازی برای شناسایی داروهای اسیدی و بازی و در بخش صنعتی که شامل آنالیز پلیمرها می شود استفاده می گردد.

Capillary isoelectric focusing (CIEF)

در این نوع از تکنیک کاپیلاری الکتروفورز مولکول های باردار به دلیل وجود میدان الکتریکی در ایزوالکتریک فوکسینگ در یک گرادیان pH حاصل از آمفولیت های دارای مقدار pI (نقطه ایزوالکتریک) در محدوده وسیعی که در بافر جداسازی حل می شود، حرکت می کنند.

Capillary isotachophoresis (CITP)

به طور کلی، تکنیک CITP با هدف جدا سازی لیپو پروتئین های سرم ایجاد گردید این روش معمولاً در آزمایشگاه های بالینی برای تعیین سطح لیپوپروتئین در سرم انسان استفاده می شود.

ابزارهای مورد استفاده در تکنیک کاپیلاری الکتروفورز

در تکنیک کاپیلاری الکتروفورز از تجهیزات مختلفی استفاده می شود که در ادامه به معرفی آنها خواهیم پرداخت.

· منبع انرژی (Power Supply)

در تکنیک CE جهت ایجاد یک جریان الکتریکی مستقیم قابل کنترل با ولتاژ بالا به منبع انرژی نیاز می باشد.

· مخزن بافر (Buffer reservoirs)

در کاپیلاری الکتروفورز به دو مخزن بافری نیاز است که در یک سطح نگهداری شوند. این مخازن حاوی محلول های آندی و کاتدی مشخصی می باشند.

· الکترود ها (Electrodes)

دو الکترود (کاتد و آند) غوطه ور در مخازن بافر متصل به منبع تغذیه در تکنیک کاپیلاری الکتروفورز جهت برقراری جریان الکتریکی مورد استفاده قرار می گیرد.

· کاپیلاری (Capillary)

کاپلاری مورد استفاده در تکنیک CE متشکل از سیلیس ذوب شده، معمولاً با قطر کمتر از 100 میکرون می باشد.

· پنجره مشاهده (Viewing window)

در این تکنیک به یک پنجره مشاهده نوری نیاز است که با آشکارساز تراز باشد.

· سیستم تزریق (Injection system)

سیستم تزریق قسمتی از دستگاه است که جهت افزودن نمونه و بافر به داخل کاپلاری طراحی شده است. در برخی موارد روش تزریق می تواند جهت بالا بردن دقت کار به صورت خودکار باشد. روش رایج تزریق نمونه ها شامل گرانش (gravity)، فشار یا خلاء (pressure or vacuum) و همچنین الکتروکینتیک (electrokinetic) است.

· آشکار ساز (Detector)

در این تکنیک به منظور نظارت بر مقدار ماده ای که در یک زمان معین از مویرگ می گذرد، تشخیص رسانایی، فلورمتری (fluorimetry)، اسپکتروفتومتری جذبی (UV و مرئی)، آمپرومتریک (amperometric) و یا طیف سنجی جرمی (mass spectrometric detection) از آشکار ساز استفاده می شود.

· سیستم ترمودینامیک (Thermostatic system)

عملکرد سیستم ترمودینامیک در CE، حفظ دمای ثابت درون کاپیلاری می باشد.

· ضبط کننده (Recorder)

این قسمت از کاپیلاری الکتروفورز به منظور ثبت داده ها طراحی شده است.

مزایای تکنیک کاپیلاری الکتروفورز

کارآمدی بالا (Highly efficient)
مدت زمان کوتاه واکنش (Less time-consuming)
حیطه کاربرد وسیع در تشخیص انواع ماکروملکول ها مانند قطعات DNA، RNA، پروتئین ها و ….
امکان انجام واکنش به صورت خودکار

معایب تکنیک کاپیلاری الکتروفورز

با وجود مزایای مختلفی که تکنیک کاپیلاری الکتروفورز دارد، اما این روش از معایبی نیز برخوردار است که عبارتند از:

چالش برانگیز بودن تغییر کاپیلاری ها : با توجه به اینکه اندازه کاپیلاری ها، برداشت و یا جایگزین کردن آنها در برخی موارد می تواند چالش برانگیز باشد. بنابراین هرگونه تغییر در کاپیلاری ها باید توسط متخصص صورت گیرد.
حساسیت بالای تکنیک کاپیلاری الکتروفورز: تغییرات کوچک مانند اندازه کاپیلاری ها و انتخاب آنالیت ها می تواند در نتایج تکنیک کاپیلاری الکتروفورز بسیار مهم باشد. بنابراین CE نسبت به سایر روش ها از حساسیت بالاتری برخوردار است.