تکنیک Allele-specific PCR

تکنیک Allele-specific PCR چیست؟

تکنیک Allele-specific PCR یا به اختصار ASPCR، از جمله روش های مبتنی بر PCR است که در زمینه شناسایی SNP های شناخته شده مورد استفاده قرار می گیرد. مفهوم AS-PCR نخستین بار توسط Newton و همکارانش ارائه گردید و با نام PCR amplification of specific alleles یا به اختصار PASA نیز شناخته شده است. متداول ترین تغییرات توالی در هر ژنوم، پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی (SNP) هستند که امروزه روش های مختلفی جهت بررسی آنها و ژنوتایپینگ از جمله AS-PCR در دسترس می باشد.

در این تکنیک مولکولی، پرایمرهای خاصی طراحی می شوند که تنها زمانی که ناحیه 3′ پرایمر به درستی متصل شده باشد، امکان انجام واکنش PCR فراهم خواهد شد. باید توجه داشت که در این تکنیک پرایمر ها برای دو توالی نرمال (Wild type) و جهش یافته (Mutant) طراحی می شوند تا SNP های مدنظر را شناسایی کنند. پس از اتمام واکنش PCR و تکثیر SNP های مختلف، با استفاده از تکنیک الکتروفورز امکان بررسی محصولات PCR فراهم می گردد. در حال حاضر، تکنیک Allele-specific PCR در زمینه های مطالعاتی و تشخیصی مختلفی نظیر فارماکوژنتیک، ژنوتایپینگ (Genotyping)، تشخیص بیماری های ژنتیکی، میکروبیولوژی و … مورد استفاده قرار می گیرد.

اساس کار تکنیک Allele-specific PCR

تکنیک Allele-specific PCR یک روش مولکولی است که منحصرا در زمینه آنالیز DNA مورد استفاده قرار می گیرد. این تکنیک عمدتاً برای تعیین ژنوتیپ SNP با کمک پرایمرهایی که به طور خاص به آلل مشخصی متصل می شوند، استفاده می گردد. اساس کار روش AS-PCR استفاده از دو پرایمر Forward مختلف طراحی شده جهت شناسایی دو آلل مختلف نرمال (Wild Type) و جهش یافته (Mutant) می باشد. انتهای 3′ این پرایمر ها دقیقا مطابق با SNP های شناهته شده طراحی می گردد. در صورتی که فرد دارای آن توالی با SNP مد نظر باشد، پرایمر متصل شده و تکثیر قطعه با کمک روش PCR انجام خواهد شد. پرایمرهای Reverse تغییری نخواهند داشت و برای هردو آلل یکسان خواهند بود.

مبنای اولیه تکنیک Allele-specific PCR استفاده از فعالیت اگزونوکلئازی آنزیم DNA Taq pol (Thermus aquaticus) مقاوم به حرارت است. این آنزیم فاقد فعالیت 3′ به 5′ اگزونوکلئازی است بنابراین در صورتی که پرایمر نتواند به درستی متصل گردد، امکان تکثیر توالی مقدور نمی باشد. باید توجه داشت که در این تکنیک نباید از آنزیم های DNA پلیمرازی که دارای ویژگی proofreading هستند، مانند Pfu (Pyrococcus furiosus) و Pwo (Pyrococcus woesei) استفاده گردد. در حالت ایده آل در زمان طراحی پرایمر، توصیه می گردد که عدم تطابق (mismatch) در موقعیت دوم نزدیک به انتهای 3′ پرایمر قرار گیرد که در این حالت دمای اتصال (annealing) برای یک آلل تغییر کرده و مانع از تکثیر متقابل (cross-amplification) نواحی غیر هدف می گردد.

پس از اتمام واکنش PCR، جهت بررسی نمونه ها می توان از تکنیک های مختلفی نظیر الکتروفورز، طیف سنجی جرمی (mass spectrometry)، ریزآرایه ها (microarrays)، fluorescence resonance energy transfer (FRET)، پلاریزاسیون فلورسانس (FP) و لومینسانس استفاده کرد. با این حال، روش الکتروفورز ساده ‌ترین و آسان‌ ترین راه برای تشخیص مکان ‌های نوارها در ژل با رنگ ‌آمیزی مستقیم با رنگ ‌های فلورسنت‌کننده مانند اتیدیوم بروماید و SYBR Green می باشد که به صورت گسترده در آزمایشگاه ها مورد استفاده قرار می گیرد.

کاربردهای تکنیک Allele-specific PCR

از تکنیک Allele-specific PCR در زمینه های مختلفی می توان استفاده کرد که در ادامه به معرفی آنها خواهیم پرداخت.

آزمایش ابوت و خویشاوندی

تست ابوت و تعیین روابط خویشاوندی (Paternity and kinship testing) با استفاده از مقایسه DNA fingerprint فرزند، پدر و مادر از جمله کاربردهای مهم تکنیک Allele-specific PCR می باشد.

تعیین ژنوتیپ و تشخیص بیماری ها

در حال حاضرتکنیک Allele-specific PCR از سریع ترین و دقیق ترین روش ها در زمینه ژنوتایپینگ و تشخیص بسیاری از بیماری های ژنتیکی است. بر اساس گزارش سازمان بهداشت جهانی (WHO)، بیماری ایسکمیک قلبی (ischemic heart disease ) اولین علت مرگ طبیعی در جهان است. نتایج مطالعات مختلف نشان می دهد که محققان با استفاده از تکنیک AS-PCR توانستند ناقلین ژنوتیپ AT در rs2274907A›T که خطر ابتلا بیماری عروق کرونر در آنها بالاتر بود را شناسایی کنند. علاوه بر این، در یک مطالعه که در سال 2012 توسط Marini و همکاران صورت گرفت دقت AS-PCR را در تشخیص عدم وجود یا حذف ژن SMN برای غربالگری معمول تشخیصی آتروفی عضلانی نخاعی (SMA) مشخص گردید.

هاپلوتایپینگ کروموزوم Y

از دیگر کاربردهای تکنیک Allele-specific PCR می توان به هاپلوتایپینگ کروموزوم Y برای مطالعه روند تکاملی انسان از دودمان پدری اشاره کرد.

غربالگری ژنتیکی جنین

این تکنیک همچنین در غربالگری ژنتیکی (genetic fetal screening) مختلف جنین از جمله تعیین جنسیت، بیماری همولیتیک جنین و نوزاد (HDFN)، تایپ رزوس D (rhesus D typing)، تغییرات ژنتیکی ارثی از پدر مانند فیبروز کیستیک و بتا تالاسمی مورد استفاده قرار می گیرد.

تعیین هویت

تکنیک Allele-specific PCR از جمله روش های متداول در زمینه تعیین هویت افراد در زمینه پزشکی قانونی و شناسایی قربانیان می باشد که در آن مارکرهای مختلف (SNPs) مورد بررسی قرار می گیرند.

محدودیت های تکنیک Allele-specific PCR

تنها قادر به شناسایی SNP با توالی های شناخته شده می باشد.
به دلیل اینکه انتهای 3′ پرایمر اختصاصی آلل ثابت است، انتخاب پرایمرهای PCR بهینه برای تکثیر DNA ژنومی همیشه ممکن نیست.
نیاز به DNA استخراج شده با کیفیت بالا