حیطه کاربرد
محصول Trita® TPMT-NUDT15 Genotyping Kit جهت ژنوتایپینگ دو ژن TPMT و NUDT15 طراحی و تولید شده است. این محصول قادر به شناسایي آلل های TPMT*3B، TPMT*3C و TPMT*2 در ژن TPMT و آلل NUDT15*3 در ژن NUDT15 می باشد. این آلل ها منجر به افزایش عوارض جانبی و سمیت داروهای خانواده تیوپورین در شیمی درمانی می گردد. اساس عملکرد این محصول، روش مولکولی Multiplex Fluorescent ARMS PCR با استفاده از DNA تخلیص شده از خون محیطی (Peripheral Blood) انسانی میباشد.
اساس عملکرد محصول
محصول Trita® TPMT-NUDT15 Genotyping Kitبه منظور شناسایی آلل های TPMT*3B، TPMT*3C و TPMT*2 در ژن TPMT و آلل NUDT15*3 در ژن NUDT15 طراحی و تولید شده است. نمونه بیولوژیک مورد نیاز جهت استفاده از این کیت، خون محیطی (Peripheral blood) انسانی میباشد. اساس عملکرد این محصول، روش مولکولی Multiplex Fluorescent ARMS PCR میباشد. در این کیت، ناحیهی ژنی مورد بررسی به گونهای انتخاب شده است که تشخیص آللهای TPMT*3B (c.460G>A)، TPMT*3C (c.719A>G) و TPMT*2 (c.238G>C) در ژن TPMT و NUDT15*3 (c.415C>T) در ژن NUDT15 را امکان پذیر میسازد. همچنین، انتخاب ناحیه ژنی قابل تکثیر و طراحی پرایمرها به صورت کاملا اختصاصی و با توجه به عدم وجود پلیمورفیسم در ناحیه اتصال پرایمرها روی ژنوم انجام گرفته است.
پس از انجام واکنش مولکولی PCR، محصول واکنش با یک ران Capillary electrophoresis در دستگاه ژنتیک آنالایزر قابل خوانش و شناسایی میباشد. پرایمرهای این محصول با رنگهای فلورسنت F6-FAMTM و ®VIC نشاندار شدهاند (جدول ۲). پرایمرهای فلورسنت نواحی مورد نظر از ژنهای TPMT و NUDT15 را در یک واکنش Multiplex تکثیر مینمایند و سپس محصول واکنش PCR با یک ران Capillary electrophoresis با دستگاه ژنتیک آنالایزر قابل شناسایی میباشد. در محصول Trita® TPMT-NUDT15 Genotyping Kit علاوه بر پیکهای اختصاصی آللهای نام برده، ۴ پیک کنترل در کانال F6-FAMTM و ۴ پیک کنترل در کانال ®VIC تعبیه شده است. آنالیز و تفسیر نتایج نهایی با نرم افزار ®GeneMarker انجام میگیرد.
| Dye color | PCR Products |
| Blue | TPMT*2 NL |
| Blue | TPMT*3C NL |
| Blue | NUDT15*3 NL |
| Blue | TPMT*3B NL |
| Blue | Controls |
| Green | TPMT*3B Mut |
| Green | NUDT15*3 Mut |
| Green | TPMT*2 Mut |
| Green | TPMT*3C Mut |
| Green | Controls |
به طور کلی، اساس عملکرد این محصول در تشخیص آلل های فوق شامل ۳ مرحله اصلی زیر میباشد که هر مرحله به شرح زیر صحه گذاری شده است که عبارتند از:
-
استخراج DNA از نمونه بیولوژیک
این محصول با نمونههای خون محیطی (Peripheral blood) انسانی، صحهگذاری شده است. همچنین، این محصول با کیت های استخراج DNA مانند کیت QIAamp® DNA Blood Mini Kit محصول شرکت Qiagen آلمان برای نمونههای خون بهینه سازی شده است.
-
واکنش مولکولی Multiplex Fluorescent ARMS PCR که شامل مراحل زیر است:
- دناتوراسیون (Denaturation)
- هیبریداسیون آغازگرهای نشاندار (Primer Hybridization)
- تکثیر مارکرهای ژنی موردنظر به روش PCR (PCR Amplification)
این محصول با دستگاه ترموسایکلر Applied Biosystem (Veriti) و BioRad (T 100) بهینه سازی شده است.
-
آنالیز قطعات تکثیر شده (Fragment Analysis) که شامل مراحل زیر است:
- جداسازی قطعات تکثیر شده (Fragment Seperation) به روش Capillary Electrophoresis
- آنالیز و تفسیر نتایج (Data Analysis) با استفاده از نرم افزار GeneMarker®
محصول PCR حاصل از این کیت با دستگاه Genetic Analyzer مدلهای(xL) ABI 3130 و ABI 3500 (xL) با کپیلاری در سایزهای 30، 50 یا 80 سانتی متر سازگار میباشد. همچنین، آنالیز و تفسیر نتایج کپیلاری الکتروفورز با استفاده از نرم افزار ®GeneMarker بر اساس پنل کیت (که توسط شرکت برای کاربران ارسال میشود) امکان پذیر است.
محتویات کیت
محصول Trita® TPMT-NUDT15Genotyping Kitدر سه مدل 25، 50 و 100 تستی قابل ارائه است. جدول زیر نشان دهندهی اجزای کیت و مقادیر هر یک از آنها در مدلهای مختلف این محصول میباشد.
| The composition of Trita® TPMT-NUDT15 Genotyping Kit | ||||
| Tube/Cap Color | Vol. for 100 rxn (µl) | Vol. for 50 rxn (µl) | Vol. for 25 rxn (µl) | Kit Contents |
| Amber/Yellow | 4 × 125 | 2 × 125 | 125 | Mix-1 |
| Clear/Red | 4 × 375 | 2 × 375 | 375 | Mix-2 |
|
* The kit contains a quick Manual inside the package. |
||||
ویژگی های فنی
در جدول زیر، مهم ترین ویژگی های فنی محصول Trita® TPMT-NUDT15 Genotyping Kitبه طور خلاصه ارائه شده است:
| Technical specification of Trita® TPMT-NUDT15 Genotyping Kit | |
| Parameters | Kit Specifications and characteristics |
| Technique | Multiplex Fluorescent ARMS PCR |
| Type of Analysis | Qualitative |
| Target Sequence | TPMT Gene
NUDT15 Gene |
| Validated Specimen | Human whole blood |
| Storage |
-20 ± 5 °C |
| Dye |
6-FAMTM, VIC® |
| Validated
Extraction Methods |
QIAamp® DSP DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Germany) |
| Validated Thermocyclers | BioRad (T 100), Applied Biosystem (Veriti), GeneAmp PCR System 9700
(Ramping rates: heating 0.8 ˚C/s, cooling 1.6 ˚C/s) |
| Validated
Genetic Analyzers |
Applied Biosystems™ 3130/3130 xL Genetic Analyzer
Applied Biosystems™ 3500/3500 xL Genetic Analyzer |
| Size standard | 560 SIZER ORANGE (Devyser-Sweden)
GeneScan™ 500 LIZ® Size Standard (Life Technologies-USA) GeneScan™ 600 LIZ® Size Standard (Life Technologies-USA) |
| Validated Software | ®GeneMarker |
