استخراج اسیدهای نوکلئیک

فرایند استخراج و خالص سازی اسیدهای نوکلئیک شامل مجموعه ‎ای از مراحل است که در نهایت منجر به حصول اسید نوکلئیک (DNA یا RNA) با خلوص مشخص و عاری از هر گونه ناخالصی می ‎شود. استخراج اسید‏های نوکلئیک معمولا با هدف تهیه DNA یا RNA جهت انجام بررسی‎ های متعاقب مانند تشخیص مولکولی بیماری‎ ها و یا بررسی‎ های پزشکی قانونی انجام می ‎شود. دسترسی به اسید نوکلیئک خالص اولین مرحله از هر نوع آزمایش مبتنی بر تکثیر اسیدهای نوکلئیک و نقطه شروع بررسی ‎های مولکولی در سطح ژن‎ ها می‏باشد. بنابراین کیفیت نوکلئیک اسید استخراج شده عامل مهمی در صحت و درستی نتایج تست‎ های تشخیصی متعاقب است. کاربرد استخراج اسیدهای نوکلئیک محدود به علم پزشکی و بیولوژی نبوده و در بسیاری از حوزه‎ ها مانند کشاورزی، دامپزشکی، باستان شناسی و … تاثیر گذار است.
با توجه به هدف مطالعه و نمونه‎ های در دسترس، اسیدهای نوکلئیک را می‎توان از منابع مختلف استخراج کرد؛ تمام سلول‎ ها و بافت‎ های مختلف انسانی و حیوانی مانند خون، بزاق، مو، ادرار، مدفوع، دندان و استخوان منابع استخراج DNA و یا RNA هستند. به عنوان مثال برای تشخیص بیماری‎ های ژنتیکی مثل تالاسمی، دستروفی عضلانی دوشن، هانگتینتون و سیستیک فیبروزیس از DNA استخراج شده از سلول‎ های خونی استفاده می‎ شود. برای تشخیص عفونت‎ های ویروسی مانند HIV و HBV از سرم و پلاسما استخراج انجام می‎ شود. جهت ردیابی حضور ویروس هرپس و عفونت ‎ها و تورم مغزی (آنسفالیت) می‎توان از DNA و RNA استخراج شده از مایع مغزی-نخاعی استفاده کرد. حضور سلول‎ های توموری مربوط به دستگاه گوارش با استفاده از اسید نوکلیئک استخراج شده از نمونه مدفوع بررسی می‎ شود. بسیاری از بیماری‎ های ژنتیکی پیش از تولد نوزاد با بررسی DNA استخراج شده از نمونه مایع آمنیوتیک، پرزهای جنینی و بلاستومر قابل تشخیص هستند. در بررسی‌های جنایی و پزشکی قانونی نیز استخراج DNA از نمونه‎ هایی مثل ته ‎سیگار، آدامس و حتی گرد و خاک موجود در فضای بررسی قابل انجام است؛ زیرا احتمال وجود سلول‎ های پوست و موی مظنونین در این نمونه‎ ها وجود دارد. همچنین سلول‎ ها و بافت‎ های گیاهی مثل برگ، میوه و چوب نیز منابع استخراج اسیدهای نوکلئیک هستند. در برخی موارد لازم است اسید نوکلئیک مورد نظر از روی ژل (آگارز یا آکریل آمید) و یا از محصول به دست آمده از واکنش PCR استخراج و خالص سازی شود.
هر چند استخراج اسیدهای نوکلئیک از منابع مختلف و با روش‎ های مختلفی انجام می‎ شود، اما مراحل اصلی استخراج با اهداف مشابهی انجام می‎ شود. هدف از انجام مراحل مختلف فرایند استخراج هضم پوشش سلول (غشا یا دیواره سلولی) و حذف لیپیدها، پروتئین‎ ها و سایر ناخالصی‌ها جهت دستیابی به مولکول‎ های DNA و یا RNA خالص است. این مراحل عبارتند از 1) لیز سلول‎ ها برای آزاد شدن اسید نوکلئیک، 2) خالص سازی اسید نوکلئیک و 3) رسوب دادن، شستشو و تغلیظ.
1) روش ‎های مختلفی برای لیز سلولی وجود دارد که به طور کلی به دو گروه شیمیایی و مکانیکی طبقه بندی می ‎شوند؛ روش ‎های شیمیایی شامل هضم آنزیمی (پروتئیناز یا لیزوزیم)، شوک اسمزی (استفاده از عامل‎ های کائوتروپیک)، استفاده از دترجنت‎ها، تیمار قلیایی و … است و روش‎ های مکانیکی شامل خرد کردن، آسیاب کردن، ساییدن در هاون در حضور نیتروژن مایع، استفاده از امواج فراصوت توسط سونیکاتور و … می‎باشد. روش‎ های مکانیکی سبب شکسته شدن مولکول‎ های DNA می‎ شوند؛ بنابراین در مواردی که به قطعات سالم و کامل DNA نیاز است بهتر است از هضم آنزیمی (لیزوزیم و پروتئیناز K) و شوینده ‎ها برای لیز سلولی استفاده شود. عصاره سلولی حاصل از هضم سلول ترکیبی از اسیدهای نوکلئیک، پروتئین‎ ها و چربی‎ هاست؛ حذف این ناخالصی‎ ها از اسید نوکلئیک مورد نظر را خالص سازی می‎گویند.
2) روش ‎های خالص سازی اسیدهای نوکلئیک نیز متنوع است و به طور کلی شامل روش‎ های solution-based و روش ‎های Column-based می‎ شود. این مرحله شامل حذف ناخالصی ‎ها، چربی‎ ها و پروتئین ‎هاست؛ استفاده از محلول فنل-کلروفرم یکی از روش‎ های خالص ‎سازی است؛ فنل باعث دناتوره شدن پروتئین می‎ شود و بعد از سانتریفیوژ کردن پروتئین رسوب کرده و فاز آبی حاوی اسیدهای نوکلئیک است. یکی از روش ‎های دیگر استفاده از ستون‎ های خالص سازی است؛ اسید‎های نوکلئیک بر اساس pH و غلظت نمک روی یک سطح جامد (solid phase) مانند سیلیکا یا مواد دیگر متصل شده و از سایر ناخالصی‌ها جدا می ‎شوند.
3) مرحله رسوب دادن اسیدهای نوکلئیک با استفاده از الکل‎ هایی مثل اتانول و ایزوپروپانول انجام می‎ شود؛ از آنجایی که اسیدهای نوکلئیک در الکل نامحلول هستند، به کمک سانتریفیوژ کردن رسوب کرده و از سایر مولکول‎ها جدا می ‎شوند.
به طور کلی روش‎ های استخراج و خالص سازی اسیدهای نوکلئیک را می‎توان به دو گروه روش ‎های شیمیایی (Chemical-drived method) و روش ‎های فاز جامد (Solid-phase method) طبقه بندی کرد. روش‎ های شیمیایی با تکیه بر ویژگی‎ های بیوشیمیایی مولکول ‎ها به استخراج مولکول دلخواه می‏پردازند در حالی که روش‎ های فاز جامد بر اساس فاز مایع و فاز ثابت و خواص یونی، هیدروفوبی و قطبیت مولکول دلخواه و یک ماده جاذب عمل می‎کنند و نوع پیوند (وان‎دروالسی، یونی و هیدروژنی) بین مولکول مورد نظر و جاذب اساس روش را تعیین می ‎کند.
روش شیب چگالی سدیم کلرید یکی از روش ‎های شیمیایی استخراج اسیدهای نوکلئیک است؛ اساس این تکنیک استقرار اسید نوکلئیک در نوار اختصاصی خود در شیب چگالی سدیم کلرید است، در این روش محلول سدیم کلرید و عصاره سلولی برای چند ساعت سانتریفیوژ می ‎شوند و در شیب چگالی به وجود آمده مولکول‎ ها بر اساس چگالی شناوری ویژه خود تفکیک می‎ شوند. پروتئین‎ ها دانسیته کمتری دارند و RNA و پلازمیدهای دارای سوپرکویل نسبت به DNA دارای دانسیته بیشتری هستند. در نهایت برای مشاهده باند DNA از اتیدیوم برماید استفاده می‎ شود. این روش در استخراج پلازمید کاربرد دارد. استخراج پلازمیدها از کشت باکتری مانند روش کلی خالص‎سازی DNA از سلول است؛ اما در استخراج پلازمید لازم است که DNA پلازمیدی از مقدار زیادی DNA باکتریایی موجود در سلول جدا شود. برای این منظور روش ‎های مختلفی وجود دارد که یکی از آن‎ ها شیب چگالی سدیم کلرید است.
استخراج قلیایی نیز در جداسازی DNA پلازمیدی از DNA کامل کاربرد دارد؛ الکل باعث دناتوره شدن DNA کامل می‎ شود اما با پیوند کووالانسی به DNA پلازمیدی متصل می‎ شود. پس از خنثی سازی DNA کامل به حالت اولیه برگشته و رسوب می‎ کند درحالی که DNA پلازمیدی در فاز آبی می ‎ماند.
استفاده از محلول گوانیدین تیوسیانات-فنل-کلروفرم و سانتریفیوژ کردن نیز یکی دیگر از روش‎ های شیمیایی استخراج است که در استخراج تک مرحله‎ ای RNA کاربرد دارد. در این روش پس از سانتریفیوژ کردن، مولکول ‎های RNA در فاز آبی (بالایی) و DNA و پروتئین‎ ها در فاز میانی یا پایین‎تر قرار می‎گیرند.
یکی دیگر از روش‎ های شیمیایی استفاده از محلول Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) است؛ این ماده نوعی دترجنت است که با اسیدهای نوکلئیک کمپلکس تشکیل داده و رسوب می‎ کند درحالی که به بقیه مواد موجود در عصاره سلولی متصل نمی‎ شود. رسوب به دست آمده با نمک شستشو داده می‎ شود و اسید نوکلئیک با استفاده از الکل رسوب داده می‎ شود. این روش برای استخراج اسید نوکلئیک از بافت‎ های گیاهی کاربرد دارد.
یکی دیگر از روش‎ های شیمیایی، استفاده از ذرات Chelex است؛ Chelex ذرات آنیونی مصنوعی هستند که به صورت جاذب یون‎ های چند ظرفیتی مثل منیزیم عمل می‏کنند؛ حذف این یون‎ ها باعث تخریب و غیر فعال شدن آنزیم‎ های هیدرولیز کننده DNA می‎ شود.
از روش‎ های مبتنی بر فاز جامد می‎توان به کروماتوگرافی با رزین‎ های Anion Exchange و ماتریکس‎های متصل شونده به اسیدهای نوکلئیک اشاره کرد. ملکول‎ های اسید نوکلئیک با بار منفی تمایل به اتصال به ذراتی از جنس سیلیکا، شیشه و یا سلولز با بار مثبت دارند، درحالی که دیگر مولکول‎ های موجود در عصاره سلولی اینگونه نیستند و به راحتی با شستشو حذف می‎ شوند. اتصال موثر اسیدهای نوکلئیک به سیلیکا اساس عملکرد تکنولوژی ستون‎ های حاوی غشاهای سیلیکایی است.
جهت استخراج DNA از ژل آگارز و محصول PCR نیز استفاده از روش ‎های مبتنی بر ستون کاربرد دارد. برای این منظور باید از درصدهای پایین تر آگارز استفاده شود. پس از الکتروفورز و تفکیک DNA بر حسب اندازه، قطعه مورد نظر برش داده می‎ شود و با استفاده از کیت‎ های استخراج از ژل که واجد سیستم بافری مناسب جهت هضم ژل و ستون‎ های حاوی غشای سیلیکایی DNA خالص سازی می‎ شود.
روش Magnetic Beads نیز یکی دیگر از روش‎ های فاز جامد است؛ در این روش ذرات مغناطیسی عامل‎دار شده به همراه سیستم بافری مناسب به صورت اختصاصی اسید نوکلئیک مورد نظر را از عصاره سلولی جدا می‎ کند.
از آنجایی که روش ‎های استخراج و خالص‎ سازی بسیار متنوع است، برای انتخاب روش و‎ تکنیک استخراج و خالص سازی اسیدهای نوکلئیک باید عواملی مانند هدف استخراج، نوع آنالیزهای پایین دستی (PCR، Cloning، blotting و ….) ، نوع اسید نوکلئیک هدف (ssDNA، dsDNA، total RNA، mRNA و …)، ارگانیزم منشاء (گیاه، جانور، پروکاریوت، ویروس و …)، نوع نمونه (اندام، بافت، کشت سلولی، خون و …) و نتیجه مورد انتظار (خلوص، بازدهی، زمان لازم برای استخراج) را در نظر گرفت. بسیاری از روش ‎های استخراج اسیدهای نوکلئیک که برای انواع مولکول‎ های DNA (ژنومی، پلازمید و ….) به کار می‎رود، با اندکی تغییر برای انواع مولکول‏ های RNA (mRNA، tRNA، miRNA و …) نیز قابل استفاده هستند. در واقع هنگام استخراج اسیدهای نوکلئیک DNA و RNA با هم خالص می‎ شوند و با روش‎ هایی باید DNA عاری از RNA و یا RNA عاری از DNA به دست آورد. RNA مولکولی ناپایدار است و نیمه عمر کوتاهی دارد، بنابراین باید از نمونه  ‎های تازه جهت استخراج RNA استفاده شود. روش ‎های آزمایشگاهی استخراج RNA باید مبتنی بر روش‎ های عاری از RNase باشد. در استخراج RNA حذف مواد زائد اهمیت زیادی دارد و استفاده از ترکیباتی مانند ترایزول، کلروفرم و ایزوپروپانول باعث حذف لیپیدها، کربوهیدرات‎ ها، پروتئین‎ ها و DNA می ‎شود.
امروزه روش‏ های مولکولی به دلیل حساسیت و اختصاصیت بالا جایگاه ویژه‎ای در تشخیص بیماری‎ های ژنتیکی و عفونی دارند؛ لازمه انجام تست‎ های تشخیصی مولکولی، استخراج اسیدهای نوکلئیک است. یک روش بهینه استخراج روشی سریع، مقرون به صرفه، ایمن و دارای حساسیت و اختصاصیت بالا است. با این حال هر روش معایب و مزایایی دارد و باید با توجه به هدف مطالعه و نوع نمونه روش مناسب انتخاب شود.
یکی از جنبه ‎های کاربرد استخراج DNA در حوزه پزشکی، تشخیص پیش از تولد بیماری‎ های ژنتیکی است؛ برای این منظور مولکول‎ های DNA از مایع آمنیوتیک و یا پرزهای جنینی استخراج می‎ شود. روش انتخاب شده برای این هدف باید باعث حصول DNA با خلوص و کیفیت مناسب برای استفاده در واکنش‌ های پایین دستی باشد. در گذشته به طور سنتی روش فنل-کروفرم و رسوب با الکل برای استخراج DNA از مایع آمنیوتیک و پرزهای جنینی استفاده می شد؛ روش‏ های سنتی زمان‎بر، گران قیمت و نیازمند استفاده از مواد سمی و خطرناک هستند. امروزه استفاده از کیت‎ های تجاری مبتنی بر تکنولوژی استخراج ستونی جایگزین روش‎ های سنتی شده است. اساس عملکرد این کیت‎ ها اتصال موثر DNA با غشاهای سیلیکایی است. استفاده از این کیت‎ ها آسان و سریع بوده و DNA حاصل کیفیت لازم برای استفاده در واکنش‎ های پایین دستی را دارد.
واکنش‎ های PCR در تشخیص بسیاری از عوامل عفونت ‎زا کاربرد دارد. با استخراج اسید نوکلئیک از خون امکان تشخیص ویروس، باکتری و قارچ وجود دارد. در خون کامل بازدارنده‎ های PCR مانند هموگلوبین وجود دارد. کیت‎ های تجاری که در پروتوکل آن‎ ها لیز حرارتی و شستشوی قلیایی اعمال می‎ شود به دلیل حذف بازدارنده‎ ها بازیابی بهتری در استخراج DNA دارند. برای استخراج اسید نوکلئیک از خون استفاده از روش ‎های مبتنی بر ستون سریع و آسان است و نیازی به محلول‎ های آلی خطرناک ندارد. اسید نوکلئیک استخراج شده با این روش، خلوص و کیفیت لازم برای واکنش ‎های متعاقب را دارد.
بافت نیز یکی از نمونه ‏های مهم در تشخیص‎ های بالینی است؛ مقاطع بافتی که به روش‎ های هماتوکسیلین ائوزین رنگ آمیزی می‎ شوند و اغلب درفرمالین فیکس شده ‎اند و در بلوک‎ های پارافینی نگهداری می شوند قابلیت استخراج اسید نوکلئیک را دارند. DNA موجود در این نمونه ها را میتوان استخراج و PCR نمود. در ابتدا مقاطع بافتی از بلوک‎ های پارافینی بافت‎ ها برش داده شده و سپس پارافین اطراف مقاطع بافتی ذوب و نمونه رنگ آمیزی شده و روی لام زیر لامل قرار می گیرد. جهت استخراج DNA ازچنین نمونه هایی ابتدا بایستی رزین های نگهداری کننده لامل برروی لام را برای مدت 1 تا 2 روز در گزیلن به صورت محلول در آورد . سپس مقاطع بافتی را در لوله میکرو سانتریفوژ تراشیده و با پروتئناز K برای حداکثر 3 روز انکوبه نمود متعاقباً نمونه دپروتئینه شده و بقایای تجزیه شده پروتئین را با اتانول رسوب داده و برای PCR آماده نمود.
یکی دیگر از جنبه ‎های کاربردی استخراج اسیدهای نوکلئیک و تکثیر آن توسط واکنش PCR، مطالعات باستان شناسی مولکولی است؛ این مطالعات بازسازی تطور قومیت‎ های مردم جهان را مسیر می‎ کند. در این مطالعات مولکول‎ های DNA باید از بافت‎ های استخوان، دندان و موی اجساد استخراج شود. این بافت ‎ها باید تحت شرایط خاص به پودر تبدیل شده و سپس با روش مناسب استخراج انجام شود؛ مراحل استخراج DNA از این بافت‎ ها مانند سایر بافت‎ های طبیعی است اما نکته حائز اهمیت در این مطالعات این است DNA پس از مرگ جاندار شروع به زوال می‎ کند و آنزیم‎ های برشی منجر به قطعه قطعه شدن DNA می‎ شوند. همچنین عوامل فیزیکی و شیمیایی، اکسیداسیون و هیدرولیز باعث تخریب ساختار DNA موجود در نمونه‎ های باستانی می ‎شد. بنابراین این نمونه‎ ها غالبا حاوی DNA شکسته با وزن مولکولی پایین و همراه با انواع مختلفی از مهارکننده‎ های PCR هستند. لذا روش مناسب برای استخراج این نوع از DNA باید به دور از شوینده‎ های قوی و دمای بالا یا پایین بوده و قادر به حذف مهارکننده ‏ها و بازیابی حداکثر DNA باشد. به عنوان مثال تیمار نمونه استخوان و دندان اجساد کشف شده در منطقه بهشهر مازندران (گوهر تپه) با محلول بافری حاوی EDTA و پروتئیناز K (جهت حذف مهار کننده‎ ها) و سپس استفاده از دانه‎ های سیلیکا (کیت GenejetTM silica bead شرکت فرمنتاس-آلمان) منجر به استخراج موفقیت آمیز DNA از این نمونه ‎ها شده است. روش ‎های استخراج DNA از بافت‎ های استخوان، دندان، مو و ناخن و بررسی‎ های مولکولی متعاقب امکان تفحص شهدای گمنام و تشخیص هویت اجسادی که قابل شناسایی نیستند را فراهم می‎ کند. این تفحص و شناسایی از طریق تطابق اطلاعات ژنتیکی به دست آمده از نمونه با اطلاعات ژنتیکی خانواده فرد انجام می ‎شود. در صورت تهیه بانک ژنی از توالی DNA افراد و اختصاص کارت هویتی به هر فرد می‎توان در صورت لزوم با وجود یک تار مو یا یک قطره خون هویت فرد را شناسایی کرد.