BRAF

ژن BRAF و اهمیت آن در بروز بیماری ها

نتایج مطالعات نشان می دهند که اغلب سرطان ها به دلیل جهش در یک ژن ایجاد نمی شوند بلکه تولید سلول های سرطانی ناشی از تجمع تغییرات ژنتیکی و اپی ژنتیکی زیادی است که در طول سال ها رخ داده است. در دهه ‌های 1970 و 1980، با تکیه بر کشف پروتوآنکوژن Src و سرکوبگر تومور Rb، بسیاری از چنین ناهنجاری‌ های مولکولی عامل بروز سرطان ‌ها شناسایی شدند. پروتوآنکوژن B-Raf، یک سرین/ترئونین کیناز (BRAF) است که از جمله متداول ترین انکوژن ‌های جهش ‌یافته در تومورزایی انسانی است که به خوبی مورد بررسی قرار گرفته است. طیف تومورهای حاوی جهش های BRAF اساساً همه اندام های بدن را درگیر کرده و باعث بروز بدخیمی های بسیار تهاجمی و نئوپلاسم می شود.

جهش در BRAF، یک عامل بسیار کلیدی در بروز سرطان ها با منشا بافتی چندگانه می باشد. نتایج مطالعات مختلف نشان می دهند که تقریبا 60 درصد از ملانوم ها ناشی از بروز جهش در ژن BRAF هستند. علاوه بر این، جهش در این ژن در لنفوم غیر هوچکین (non-Hodgkin’s lymphoma)، سرطان کولورکتال، کارسینوم تیروئید پاپیلاری (papillary thyroid carcinoma)، NSCLC، گلیوبلاستوما و همچنین بیماری های التهابی نیز وجود دارد. در کارسینوم پاپیلاری تیروئید، 60 درصد موارد، ناشی از موتاسیون های فعال کننده ژن ‌های کدکننده مؤثر در مسیر سیگنالینگ MAPK، از جمله BRAF و RAS هستند. در سرطان های روده بزرگ انسان، 46 درصد موارد جهش یافته BRAF هستند.

ساختار BRAF و مسیر سیگنالینگ آن

در ژنوم انسان، ژن پروتوآنکوژن B-raf (BRAF) روی کروموزوم 7 (7q34) قرار دارد و کد کننده پروتئین BRAF می باشد. محصول ژن BRAF از 766 اسید آمینه تشکیل شده است. در حالی که تمام پروتئین های RAF می توانند فاکتور MEK (MEK1 و MEK2) را فسفریله کنند، اما BRAF قوی ترین ظرفیت فعال سازی را دارد. بر این اساس، مسیر سیگنالینگ پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن / کیناز سیگنال خارج سلولی (MAPK/ERK) (که همچنین به عنوان مسیر Ras-Raf-MEK-ERK شناخته می شود) فعال شده و در نتیجه تکثیر، تمایز و آپوپتوز سلولی در پاسخ به محرک های خارج سلولی تنظیم می گردد.

از جمله محرک های این مسیر سیگنالینگ می توان به سیتوکین ها، فاکتورهای رشد، هورمون ها و عوامل استرس زای محیطی اشاره نمود. فعال ‌سازی مسیر Raf-MEK-ERK همچنین در القای بیان بسیاری از ژن‌ های هدف نیز نقش مهمی ایفا می کند. در مسیر سیگنالینگ BRAF، فاکتور ERK (ERK1 و ERK2) توسط MEK در سیتوپلاسم فعال شده و به هسته سلول منتقل می گردد. در هسته، فاکتور های ERK1/2 از طریق فسفوریلاسیون به وسیله بسیاری از فاکتورهای رونویسی فعال می شود. بی نظمی در مسیر سیگنالینگ MAPK/ERK به دلیل جهش در پروتئین های تشکیل دهنده این مسیر، از جمله RAS (KRAS و NRAS) و RAF (BRAF)، با بسیاری از انواع سرطان مرتبط است.

در ساختار پروتئین BRAF سه دومین (domains) بسیار حفاظت شده (CR1، CR2 و CR3) مشاهده می شود. CR1 و CR2 از نواحی تنظیمی هستند که در سمت ترمینال N پروتئین قرار دارند. CR1 دارای دومین اتصال RBD (RAS-binding domain) است که با RAS و دامنه غنی از سیستئین (cysteine-rich domain) یا CRD که دو یون روی (zinc) را به هم متصل می کند، تعامل دارد. CR2 یک دارای یک دومین غنی از سرین/ترئونین به همراه محل اتصال (binding site) است. از سوی دیگر، CR3 دارای یک دومین کیناز است که در ترمینال C قرار داشته و از طریق فسفوریلاسیون تنظیم می گردد. دومین BRAF کیناز به وسیله دو بخش شناسایی می شود که شامل یک N-terminal lobe کوچک و C-terminal lobe بزرگ است. لوب کوچک حاوی یک حلقه اتصال دهنده ATP فسفات غنی از گلیسین است که به عنوان حلقه P نیز شناخته می شود. در حالت غیرفعال BRAF کیناز، یک ساختار کریستالی نشان می‌ دهد که در آن حلقه P و بخش فعال‌ سازی با موتیف Asp-Phe-Gly (DFG) در نزدیکی یکدیگر قرار گرفته ‌و احتمالاً به دلیل مجموعه‌ای از فعل و انفعالات آبگریز تثبیت شده اند.

در میان تمام پروتئین های اعضای خانواده RAF، BRAF فعال کننده اصلی MEK کینازها است. از این رو، فسفوریلاسیون ثابت پروتئین BRAF در موقعیت S446 و اسید آسپارتیک با بار منفی در موقعیت D448 و D449 صورت می گیرد. بخش فعال ‌سازی BRAF کیناز از نظر تکاملی در میان بسیاری از گونه ‌ها حفاظت شده است. علاوه بر این، جهش‌های BRAF در بسیاری از انواع سرطان ‌ها یافت می گردد و جهش‌ ها با توجه به مسیر های فعال ‌سازی به سه زیرگروه طبقه ‌بندی می ‌شوند که در ادامه به معرفی آنها خواهیم پرداخت.

طبقه بندی جهش های BRAF

به طور کلی، در ژن BRAF سه دسته جهش وجود دارد که در سه کلاس مختلف طبقه بندی می شوند.

Class I

کلاس I شامل جهش های BRAF V600E است و به BRAF اجازه می دهد تا به عنوان یک مونومر فعال عمل کند. حدود 7 درصد از سرطان های انسانی با جهش در BRAF همراه است و بیش از 90 درصد جهش های مشاهده شده در BRAF ، جهش V600E می باشد. جایگزینی والین (V) با اسید گلوتامیک (E) در موقعیت 600 باعث افزایش 500 برابری فعالیت کینازی شده و منجر به افزایش تکثیر سلولی خواهد شد. این جهش BRAF را به عنوان یک مونومر فعال می کند، در حالی که در نوع wild type یا نرمال، تشکیل دایمر برای فعال سازی مورد نیاز است.

Class II

جهش های کلاس II امکان ایجاد دایمرهای فعال کیناز مستقل از RAS را فراهم کرده و شامل K601E، L597Q و G469A می باشد. نتایج مطالعات مختلف نشان می دهند که حدود 13 درصد از جهش‌ های BRAF در بیماران مبتلا به سرطان ریه از نوع G469 هستند. جهش های کلاس II فعالیت فسفوریلاسیون ERK کمتری نسبت به جهش BRAF V600E نشان می دهند.

Class III

کلاس III یا دارای اختلال در فعالیت کیناز است یا غیر فعال است. جهش های کلاس III در حلقه P (G466)، حلقه کاتالیزوری (N581) یا موتیف DFG (D594، G596) قرار دارند. یکی از این موارد جهش در اسید آسپارتیک 594 (D594) موتیف DFG است که بخشی از لوپ فعال سازی (activation loop) می باشد. در اکثر پروتئین کینازها، بخش فعال سازی (activation segment) از موتیف DFG شروع می شود که نقش مهمی در شلاته کردن (chelating) منیزیم، اتصال ATP و کنترل فعالیت کیناز دارد. BRAF D594 در محل جایگاه فعال (active site) قرار دارد و جهش آن باعث کاهش فعالیت کیناز می شود که در بیماران مبتلا به انواع مختلف سرطان شناسایی شده است.

نقش BRAF در بروز سرطان ها

با توجه به اینکه تمام جهش‌ های بیماری‌ زای BRAF، صرف ‌نظر از کلاس ‌هایشان، فسفوریلاسیون ERK را فعال می ‌کنند، این فرضیه وجود دارد که فاکتور های رونویسی (TFs) تعدیل ‌شده توسط مسیر سیگنالینگ ERK، اهداف بالقوه پایین ‌دست جهش ‌های BRAF هستند. نتایج مطالعات مختلف نشان داده که در حدود 30 درصد از بافت های سرطانی مسیر سیگنالینگ RAS-RAF-MEK-ERK فعال شده است. در ادامه به معرفی برخی فاکتور های مهم در این مسیر پرداخته می شود که عبارتند از:

cMyc

یکی از شناخته شده ترین فاکتورهای رونویسی که توسط فسفوریلاسیون ERK در سلول های سرطانی تنظیم می شود، cMyc است. در آزمایشات مختلف فعال شدن مداوم cMyc زمانی که در Thr58 و Ser62 فسفریله بود، یافت شد. این فسفوریلاسیون از تخریب پروتئین جلوگیری می کند. علاوه بر این، جهش cMyc در Thr58، که از تخریب cMyc جلوگیری می کند، مقاومت در برابر مهار FGFR در چندین رده سلولی سرطانی وابسته به FGFR نشان داده است. این نتایج نشان می‌دهد که فسفوریلاسیون ERK با واسطه جهش BRAF باعث پایداری cMyc شده و ممکن است سیگنال تومورزایی را از جهش ‌های BRAF منتقل کند.

cFos

یکی دیگر از فاکتور های ERK رونویسی انکوژنیک مهم مبتنی بر فسفوریلاسیون(ERK phosphorylation-driven oncogenic transcription factor)، cFos می باشد. cFos یک فاکتور رونویسی است که یک ساختار هترودایمر با c-Jun تشکیل می دهد و به عنوان پروتئین فعال کننده AP1 (activator protein-1) عمل می کند. این پروتئین دایمر AP1 به AP1-specific DNA sequence در نواحی پروموتر و enhancer در ژن های هدف متصل می گردد. علاوه بر c-Jun، cFos با چندین فاکتور رونویسی هسته ‌ای مانند NCOA1 و SMAD3 که توسط فسفوریلاسیون ERK تنظیم می ‌شوند، نیز در تعامل است. در مجموع، فرض بر این است که فسفوریلاسیون ERK با واسطه جهش BRAF می تواند فعالیت و بیان برخی ژن ها در سلول های سرطانی تغییر داده و فنوتیپ های توموری را بروز دهد.

SMAD

جدای از فاکتور های رونویسی که به خوبی مورد مطالعه قرار گرفته اند، بیش از 100 فاکتور رونویسی به عنوان اهداف فسفوریلاسیون ERK شناسایی شده اند. در میان آنها، فاکتور متعددی وجود دارد که معمولاً در خارج هسته قرار گرفته و پس از فسفوریلاسیون ERK به هسته منتقل می شوند. یکی از این فاکتور ها SMAD 1-4 می باشد که حد واسط مسیر سیگنالینگ TGF-β است که به عنوان یک تنظیم کننده مهم در TEM (epithelial to mesenchymal transition) شناخته می شود. مسیر سیگنالینگ به این شکل است که در ابتدا TGF-β1 به گیرنده II خود (TβRII) متصل شده و گیرنده TGF-β نوع I (TβRI) -کیناز را فعال می کند.

این فعال شدن منجر به فسفوریلاسیون SMAD2 و SMAD3 در سیتوپلاسم می شود. پس از آن، کمپلکس SMAD2/3 به SMAD4 متصل شده و فعال سازی خود را برای بیان ژن های هدف اعمال می کند. EMT به عنوان یک فرآیند کلیدی در متاستاز سرطان در انواع مختلف سرطان در نظر گرفته می شود. در در بسیاری از روش های درمان سرطان، مهار مسیر سیگنالینگ TGF-β با استفاده از مهارکننده های شیمیایی، انجام می شود. این یافته ها نشان می دهد که فسفوریلاسیون ERK ناشی از جهش BRAF می تواند فسفوریلاسیون SMAD2/3 را افزایش داده و ظرفیت EMT سلول های سرطانی را فعال کند.

روش های تشخیص BRAF

در حال حاضر، از روش های مختلفی جهت تشخیص جهش در ژن BRAF استفاده می شود که از متداول آنها روش توالی یابی سانگر، ایمنوهیستوشیمی (IHC) و Real-Time PCR می باشد. در ادامه به معرفی این تکنیک پرداخته می شود.

توالی یابی سانگر

تعیین توالی سانگر از دیرباز به عنوان روش مرجع برای شناسایی جهش های اکتسابی در تومورها در نظر گرفته شده است. حساسیت روش توالی یابی Sanger برای تشخیص V600E حدود 5/92% می باشد. به این معنی که با استفاده از این روش به تنهایی، 5/7% از بیمارانی که واجد شرایط درمان با مهارکننده های BRAF و MEK هستند، شناسایی نمی شوند. اساس این روش استفاده از دو گروه مختلف از نوکلئوتید ها به نام dNTP و ddNTP نشان دادر شده می باشد که منجر به ختم تکثیر قطعات در صورت استفاده از ddNTP می گردد. در روش سانگر، قطعاتی با طول های مختلف تولید می شوند که با استفاده از برچسب فلورسنت مورد استفاده در ddNTP ها توالی یابی قطعات صورت می گیرد.

ایمنوهیستوشیمی

روش ایمنوهیستوشیمی (Immunohistochemistry) یا به اختصار IHC، آزمایش مبتنی بر آنتی بادی است که به طور موثری در تشخیص جهش های V600E مورد استفاده قرار می گیرد. برای انجام این تست بسیار حساس و اختصاصی تنها به دو اسلاید بافت نیاز است و تجهیزات تخصصی مورد استفاده قرار نمی گیرد. از مزایای این تکنیک می توان به هزینه و زمان کم آن اشاره کرد، زیرا نتایج در عرض 48 ساعت به دست می آید. با این حال، IHC دارای محدودیت ‌هایی نیز می باشد که از عوامل پیش ‌تحلیلی مانند تومورهای رنگ‌آمیزی ناهمگن (heterogeneously stained tumors)، خلوص پایین تومور (low tumor purity)، نواحی تومور نکروتیک (necrotic tumor areas) و شرایط تثبیت غیربهینه (suboptimal fixation condition) ناشی می ‌شود. علاوه بر این، تفسیر نتایج ایموهیستوشیمی آسان نبوده و باید توسط متخصص صورت گیرد.

Real-Time PCR

تکنیک های مبتنی بر PCR از جمله Real-Time PCR از جمله روش های کاربردی در زمینه تشخیص جهش های مرتبط با ژن BRAF به شمار می روند. نتایج بررسی های مختلف نشان می دهد که specificity این روش حدود 88 تا 100 درصد در شناسایی موتاسیون های BRAF بخصوص V600 می باشد. اساس این تکنیک استفاده از پرایمر ها و پروب های نشان دار شده برای جهش های خاص است و امکان بررسی روند تکثیر در حین واکنش فراهم می باشد.

درمان بیماری های مرتبط با جهش BRAF

تا امروز چندین دارو برای مهار مسیر سیگنالینگ BRAF موفق شده اند که تائیدیه های لازم را در یافت کنند. داروی Vemurafenib اولین دارویی است که تائیدیه FDA را دریافت نمود. Vemurafenib یک مهارکننده مولتی کیناز است که به شکل خوراکی در دسترس بوده و دارای فعالیت ضد توموری قوی در موارد مبتلا به BRAF جهش یافته می باشد. برخی جهش ها، از جمله جهش های V600، منجر به فعال شدن مداوم مسیر پایین دست BRAF می شوند که منجر به مستقل شدن مسیر سیگنالینگ از تحریک توسط فاکتور رشد می گردد.

در این حالت، اثر مهاری Vemurafenib می ‌تواند منجر به توقف تکثیر سلولی و آپوپتوز سلول تومور شود. داده های پیش بالینی فعال سازی متناقض مسیر MAPK توسط vemurafenib در تومورهای نوع wildtype BRAF را نشان می دهد که منجر به افزایش تکثیر سلولی می شود که اساس طراحی مهارکننده های نسل بعدی و همچنین ترکیب با مهارکننده های MEK و EGFR بوده است.

Dabrafenib از دیگر داروهایی مورد تائید سازمان غذا و داروی آمریکا (FDA) است که اولین تأییدیه FDA خود را در سال 2013 دریافت کرد و در حال حاضر به عنوان درمانی برای درمان بیماران مبتلا به BRAF V600E ملانوما متاستاتیک استفاده می شود. Dabrafenib یک مهارکننده رقابتی ATP برای کینازهای RAF است که فعالیت قوی در برابر جهش‌های BRAF V600 دارد.