تعیین هویت

مسئله تعیین هویت افراد جهت مشخص کردن ارتباطات بیولوژیک بین دو یا چند نفر، همواره در بین خانواده ها وجود داشته و اختلافات زیادی را ایجاد کرده است. تست های تعیین هویت با استفاده از نمونه DNA افراد، دقیق ترین روش جهت مشخص کردن پدر بیولوژیک در بحث ابوت و یا پزشکی قانونی می باشد که با کمک با کمک نمونه خون یا هر نمونه بیولوژیکی انسانی قابل انجام است. زمانی که حقوق و تکالیف پدر در میان باشد و در مورد رابطه ی پدر-فرزندی تردید وجود داشته باشد، آزمایش ابوت یا Paternity می تواند اهمیت ویژه ای پیدا کند.
دلایل مختلفی جهت انجام این دسته از تست های ژنتیکی وجود دارد که برخی از آنها شامل کسب حقوق قانونی جهت حضانت کودک، مشخص کردن هویت اجساد و شهدای جنگی، دریافت ارثیه و تعیین روابط خانوادگی می باشد. آزمایش های پدر- فرزندی و یا خویشاوندی شامل تجزیه و تحلیل DNA هر فرد برای به دست آوردن پروفایل ژنتیکی (genetic profiles) یا اثر انگشت ژنتیکی (genetic fingerprint) است که با مقایسه اطلاعات بدست آمده از دو فرد می توان رابطه بین آنها را مشخص کرد. در گذشته از روش های دیگری مانند تعیین گروه خونی، بررسی HLA افراد و … به بررسی ارتباطات خویشاوندی بین افراد پرداخته می شد که امروزه استفاده از پروفایل DNA (DNA profiling) با دقت بسیار بالاتری جایگزین شده است.
هر فرد به طور کلی، نیمی از ماده ژنتیک خود را از پدر و نیمی دیگر را از مادرش دریافت می کند. در کل ژنوم انسان، تنها حدود 2% از ژن ها کد کننده پروتئین هستند. در ژنوم هر فرد نوعی توالی های تکراری وجود دارند که منحصر به فرد بوده و از طریق ارزیابی این مارکرها می توان ارتباط خویشاوندی بین افراد و هویت آنها را مشخص نمود. پروفایلینگ DNA (DNA profiling) یا انگشت نگاری ژنتیکی (DNA Fingerprinting)، به فرآیند شناسایی افراد بر اساس ویژگی های ژنتیکی گفته می شود.

پروفایلینگDNA یک تکنیک کاربردی در بحث پزشکی قانونی و انجام تحقیقات جنایی است که مارکرهای ژنتیکی افراد مظنون به جرم را با مارکرهای ژنتیکی فرد دیگر (به عنوان مثال فرد مقتول) مقایسه کرده تا قاتل یا مجرم شناسایی گردد. یکی از مارکرهای پرکاربرد در بحث تعیین هویت، مارکر های میکروستلایت STR (Short Tandem Repeats) هستند که توالی های تکراری به طول 2 تا 7 نوکلئوتیدی (اغلب 4 نوکلئوتیدی) می باشند. تعداد تکرارهای (n) مارکر STR در افراد مختلف متفاوت و منحصر به فرد است که باعث شده از آنها به عنوان یک شاخص در تعیین هویت افراد استفاده شود. از دیگر مارکر های کلیدی در تعین هویت، مارکر SE-33 ، DNA میتوکندریایی و مارکر تعیین جنسیت Amelogenin هستند که به صورت همزمان در یک واکنش Multiplex PCR تکثیر می شوند.

نمونه های مورد استفاده جهت بررسی تعیین هویت

• نمونه خون افراد
• ناخن
• مایع آمنیوتیک جهت تعیین هویت جنین
• موی سر
• استخوان اجساد
• بزاق دهان
• نمونه CVS
• دندان

انواع مارکرهای مورد استفاده در تعیین هویت

در بحث شناسایی افراد و تعیین هویت از مارکرهای مختلفی استفاده می شود که در ادامه به معرفی آنها پرداخته خواهد شد.

1) مارکر STR

مارکر STR یا تکرارهای پشت هم کوتاه (Short Tandem Repeats)، توالی های کوتاهی از جنس DNA با طولی حدود 2 تا 6 نوکلئوتید هستند که تقریباً 3 درصد از ژنوم انسان را تشکیل می دهند. تعداد واحدهای تکرار شونده در افراد بسیار متغییر می باشد که در زمان تعیین هویت و شناسایی افراد، قدرت و دقت تشخیص را افزایش می دهد. امروزه مشخص شده است که مارکر های STR، ماهیتی غیر کد کننده (non-coding) هستند و نتایج برخی تحقیقات نشان داده که این توالی های تکراری ممکن است با مکانیسم های مختلفی در تنظیم بیان ژن ها و بروز فنوتیپ های مختلف باشند.
اداره تحقیقات فدرال آمریکا(FBI) 13 عدد مارکر STR اصلی CODIS را شناسایی کرده که اکنون به طور معمول در شناسایی افراد در ایالات متحده استفاده می شود.
CODIS یا سیستم فهرست ترکیبی (Combined DNA Index System) ، پایگاه داده ملی DNA ایالات متحده است که از سه سطح اطلاعاتی تشکیل شده است که عبارتند از:
• سطح اول: سیستم ‌های ایندکس DNA محلی یا Local DNA Index Systems (LDIS) است که منبع پروفایل‌ های DNA می باشد
• سطح دوم: سیستم‌ های ایندکس DNA حالت یا State DNA Index Systems (SDIS)است که به آزمایشگاه‌ های داخلی آمریکا اجازه به اشتراک گذاری اطلاعات را می دهد
• سطح سوم: سیستم ملی فهرست DNA یا the National DNA Index System (NDIS) است که به ایالت‌ های مختلف کشور آمریکا امکان مقایسه اطلاعات DNA خود را با دیگران فراهم می کند
نرم‌افزار CODIS بسته به نوع اطلاعاتی که در آن جستجو می ‌شود، دارای چندین پایگاه داده مختلف است. نمونه ‌هایی از این پایگاه‌ های اطلاعاتی عبارتند از، افراد مفقود الاثر، مجرمان محکوم شده، و نمونه ‌های پزشکی قانونی جمع‌ آوری ‌شده از صحنه ‌های جرم مختلف. تا قبل از سال 2017، تعداد مارکرهای STR که در CODIS معرفی شده بودند شامل 13 لوکوس اتوزوم مختلف بود که پس از آن به 20 مارکر ارتقاء یافت.
آن دسته از مارکرهای CODIS که درون یک ژن قرار دارند، از روی نام همان ژن نام گذاری شده اند. به عنوان مثال، مارکر TPOX درون ژن پراکسیداز تیروئید انسانی قرار دارد. در خصوص مارکرهایی که درون ژن خاصی نیستند سیستم نام گذاری خاصی طراحی شده است که با حرف D آغاز میگردد. D نماد کروموزوم است و عددی که پس از آن قرار می گیرد شماره کروموزوم را مشخص می کند (D2 یعنی مارکری که روی کروموزوم شماره 2 قرار دارد). بعد از شماره کروموزوم حرف S قرار می گیرد و اعداد پس از آن موقعیت مارکر را مشخص می کنند. 20 مارکر STR اصلی CODIS عبارتند از:

20 مارکر CODIS
D8S1179	D7S820	D5S818	D3S1358	CSF1PO
FGA	D21S11	D18S51	D16S539	D13S317
D2S1338	D2S441	TH01	TPOX	vWA
D22S1045	D1S1656	D12S391	D19S433	D10S1248

2) مارکر Y-STR:

مارکرهای Y-STR، یک تکرار کوتاه متوالی یا STR هستند که روی کروموزوم Y در مردان واقع شده اند. با توجه به اینکه Y-STR تنها در مردان دیده می شود، اغلب در تعیین رابطه پدر-فرزندی و شناسایی مردان کاربرد داشته و آنالیزهای محدود تری نسبت به مارکرهای قرار گرفته روی کروموزوم های اتوزوم ارائه می دهد. این مارکر تنوع را در بین افراد مذکر جامعه نشان داده و اغلب کیت های Multiplex Y-STR لوکوس های مختلفی از کروموزوم Y را مورد ارزیابی قرار می دهند. سیستم نام گذاری مارکرهای Y-STR با حروف DYS (DNA Y-chromosome Segment) آغاز شده و اعداد پس از آن نشان دهنده موقعیت ان لوکوس می باشند مانند DYS455 که توالی آن AAAT می باشد.

3) مارکر DNA میتوکندریایی

میتوکندری یکی از اندامک های سیتوپلاسمی در موجودات یوکاریوت است که در زمینه تولید انرژی مورد نیاز سلول ها فعالیت می کند. DNA آن حلقوی بوده و از 37 ژن تشکیل شده است و هر سلول می تواند دارای یک یا چند عدد از این اندامک باشد. در ژنوم میتوکندری علاوه بر 37 ژن، ناحیه ای تحت عنوان control region وجود دارد که شامل دو توالی بسیار متغییر HSV1 (342 nt) و HSV2 (286 nt) است. نرخ بروز تغییرات در دو ناحیه HSV1 و HSV2 بسیار بالاست که می توان از آن در جهت شناسایی افراد استفاده کرد. از سوی دیگر، به دلیل بالا بودن درصد GC ژنوم میتوکندری، در مقابل حرارت از پایداری بالایی برخوردار می باشد.
DNA میتوکندریایی (mtDNA) دارای مارکرهای کاربردی در زمینه پزشکی قانونی و تعیین هویت افراد است که به دلیل تعداد کپی های بالا (high copy number) ، داشتن وراثت مادری و نرخ نوترکیبی پایین آن می باشد. تعیین هویت افراد برای اهداف پزشکی قانونی اغلب از طریق پروفایل های ژنتیکی با کمک ژنوم هسته ای و از مارکر های STR انجام می شود. در برخی موارد، مارکرهای STR اتوزوم به علت قدیمی بودن نمونه DNA بشدت تخریب شده اند و یا اینکه مقدار DNA استخراج شده از نمونه بسیار پائین می باشد که در این حالت می توان از مارکر های میتوکندریایی جهت تعیین هویت استفاده کرد.

4) مارکر آمیلوژنین (Amelogenin Marker)

امروزه تعیین ژنوتیپ (Genotyping) ژن آمیلوژنین واقع شده روی کروموزوم های X و Y برای پروفایلینگ DNA به منظور شناسایی و تعیین هویت افراد مورد استفاده قرار می گیرد. ژن آمیلوژنین تنها دارای یک کپی روی کروموزوم X (AMELX) با موقعیت Xp22.1-Xp22.3 و کپی دیگر روی کروموزوم Y (AMELY) با موقعیت Yp11.2 است که توالی آنها به شدت حفاظت شده می باشد. با توجه به اینکه این ژن تنها روی کروموزوم های جنسی X و Y قرار دارد، می توان از آن در تعیین جنسیت استفاده کرد.
پرایمرها به اولین اینترون در ژن آمیلوژنین (در کروموزوم های X و Y) متصل شده و دو ناحیه که از لحاظ طول توالی هستند تکثیر خواهند شد. اینترون 1 در AMELX دارای یک حذف 6 جفت بازی در مقایسه با AMELY است. قطعه تکثیر شده از کروموزوم X دارای 106 جفت باز و قطعه دیگر از کروموزوم Y دارای 112 جفت باز می باشد که وجود این دو محصول نشان دهنده ژنوتیپ نر و یک محصول نشان دهنده ژنوتیپ ماده می باشد.

5) مارکر SE-33

یکی از مارکرهایی که به شکل متداول در کیت های STR تعیین هویت بررسی می گردد، مارکر SE-33 می باشد. مارکر SE-33 یا ژن ACTBP2 (لوکوس کاذب مرتبط با ژن کد کننده بتا اکتین انسانی) روی کروموزوم 6 با موقعیت 6q14 قرار دارد. SE-33 پلی مورفیک ترین لوکوس است که دارای 53 آلل قابل تشخیص و 292 ژنوتیپ در میان 938 فرد غیر خویشاوند در ایالات متحده می باشد. با توجه به تنوع و پلی مورفیک بودن این ژن، امروزه به عنوان یک مارکر در تعیین هویت افراد در پروفایلینگ DNA مورد بررسی قرار می گیرد.
انواع آزمایشات تعیین هویت پیش از تولد
در بسیاری از مسائل خانوادگی نیاز به انجام آزمایش ابوت یا Paternity بین پدر و جنین است که از طریق روش های مختلفی می توان نمونه برداری جنین را انجام داد. برخی از روش های تعیین هویت پیش از تولد تهاجمی و برخی دیگر غیر تهاجمی می باشند. انواع این روش ها عبارتند از:
• روش تهاجمی آمنیوسنتز: در این روش نمونه DNA مورد نیاز از طریق جمع آوری مقداری از مایع آمنیوتیک اطراف جنین بدست می آید. در این روش خطر سقط جنین وجود دارد و انجام آن دارای محدودیت زمانی (بین هفته های 15 تا 20 بارداری) می باشد.
• تست غیرتهاجمی NIPT: در این تست از نمونه خون مادر که دارای DNA جنین است جهت تست ابوت استفاده می گردد.
• روش تهاجمی CVS: این روش نمونه برداری از بافت جفت صورت می گیرد که اغلب بین هفته های 10 تا 13 بارداری انجام شده و خطر سقط جنین وجود دارد.

تکنیک های مورد استفاده در تعیین هویت

تکنیک های مختلفی می توانند در زمینه انجام تست های Paternity استفاده شوند که شامل Multiplex fluorescent PCR و RFLP می باشد.

• Multiplex fluorescent PCR

در این روش Multiplex PCR به وسیله پرایمر های نشان دار شده با رنگ های فلورسنت انجام می شود که ساده، دقیق و حساس جهت انجام تست های Paternity است. در کیت های تعیین هویت تریتاژن Human Identifier Kit ® Trita از روش Multiplex fluorescent PCR و با استفاده از آللیک لدر داخلی (Internal Allelic ladder)، به تکثیر مارکر های ژنی به صورت فلورسنت پرداخته می شود. در این کیت ها به ازای هر مارکر مورد بررسی، از یک جفت پرایمر استفاده می شود که تنها یکی از آنها با رنگ فلورسنت نشان دار شده است. Internal Allelic ladder به عنوان شاخص استاندارد کیفی در تعین دقت ژنوتایپینگ مارکرهای STR در نظر گرفته می شود که به عنوان یکی از اجزای محلول کیت تعبیه شده است.
به طور کلی، آللیک لدر مخلوطی از آلل های بسیار مشخص از لحاظ توالی و سایز است که با استفاده از پرایمرهای مشابه نمونه های مورد آزمایش تولید شده و در طول الکتروفورز موئینه (Capillary Electrophoresis) به منظور تشخیص دقیق آلل ها مورد استفاده قرار می گیرد. به دلیل استفاده از تجهیزات و شرایط مختلف در آزمایشگاه ها توصیه می شود که حتما از allelic ladder در زمان ارزیابی مارکرهای STR استفاده شود. با توجه به اینکه در تکنیک کپیلاری الکتروفورز یا الکتروفورز موئینه، قطعات DNA تکثیر شده را با تفاوت یک نوکلئوتید از هم تفکیک می کند لازم است که از Allelic ladder در هر run کپیلاری الکتروفورز استفاده گردد.

• RFLP

روش RFLP (Restriction fragment length polymorphism) تکنیکی است که جهت بررسی و آنالیز پلی مورفیسم ها به خصوص تغییراتی که شامل یک نوکلئوتی (SNP) هستندانجام می گیرد. اساس کار این روش استفاده از آنزیم های محدود الاثر است که نمونه مد نظر توسط این آنزیم ها به قطعات مختلفی شکسته شده و در مرحله بعد این محصولات با کمک روش ژل الکتروفورز از هم تفکیک می گردند. روش RFLP یکی از تکنیک های مناسب جهت بررسی تفاوت های ژنتیکی بین افراد در بحث paternity می باشد.

• MLPA

تکنیک MLPA یا (Multiplex ligation-dependent probe amplification) یکی دیگر از روش های مبتنی بر PCR است که در بحث تشخیص مارکر های STR و همچنین پلی مورفیسم ها مورد استفاده قرار می گیرد. این تکنیک به صورت Multiplex PCR انجام می شود و این امکان را به کاربر می دهد تا با حداکثر 40 پروب مختلف، نواحی متعددی از ژنوم فرد را مورد بررسی قرار دهد. پروب های MLPA، به صورت دو نیم پروب 3′ half-probe و 5′ half-probe هستند که یکی از آنها مکمل یک توالی هدف خاص و دیگری یک universal primer است که امکان تقویت همزمان Multiplex PCR را برای همه پروب ها فراهم می کند. علاوه بر این، یک یا هر دو نیمه پروب حاوی یک stuffer sequence هستند که امکان تمایز قطعات با استفاده از الکتروفورز از طول خود پروب و در نتیجه اندازه متفاوت محصول تکثیر شده را فراهم می کند.

نیم پروب های مورد استفاده تنها در صورت تطابق کامل با توالی هدف منجر به تکثیر آن بخش از DNA خواهند شد. با توجه به اینکه تنها پروب هایی که فرآیند ligation آنها به طور کامل انجام شده، می توانند طی PCR تکثیر یابند، تعداد محصولات حاصل از اتصال پروب ها معیاری برای تعداد توالی های هدف در نمونه است.

پس از تکثیر، محصولات PCR بر اساس اندازه با استفاده از کپیلاری الکتروفورز (Capillary Electrophoresis) در شرایط دناتوره کردن تفکیک خواهند شد. با اندازه گیری ارتفاع یا مساحت پیک ‌های فلورسانس مشتق‌ شده از PCR ، مقدار محصول PCR پس از نرمال ‌سازی و مقایسه آن با نمونه‌ های DNA کنترل، در نتیجه مقدار نسبی توالی DNA هدف در نمونه DNA ورودی مشخص می شود.