تکنیک ARMS-PCR چیست؟

امروزه انواع تکنیک های مولکولی برای تشخیص جهش های ژنتیکی ابداع شده است، به عنوان مثال، توالی یابی سانگر، اما این تکنیک نمی تواند به سرعت تعداد زیادی جهش در نمونه ها را غربال کند. خوشبختانه، این مشکل را می توان با توالی یابی عظیم نسل بعدی (NGS) حل کرد، اما هر دو توالی یابی Sanger و NGS هزینه بالایی دارند. تکنیک ARMS-PCR یا tetra-primer amplification refractory mutation system-polymerase chain یک روش ساده و اقتصادی جهت تعیین ژنوتیپ پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی (SNPs) است. این روش یکی از دقیق ترین ابزارها در تشخیص بیماری های ژنتیکی است که امروزه به عنوان روش استاندارد طلایی (gold standard method) برای تشخیص تالاسمی و کم خونی داسی شکل معرفی می گردد.

روش ARMS-PCR مبتنی بر استفاده از پرایمرهای PCR مختص توالی است که تنها در صورت وجود آلل با توالی نوکلئوتیدی هدف در نمونه ، قطعه تکثیر خواهد شد. به دنبال انجام واکنش ARMS ، وجود یا عدم وجود محصول PCR برای وجود یا عدم وجود آلل هدف تشخیصی مورد استفاده قرار می گیرد. در این روش از دو پرایمر استفاده می گردد که یک پرایمر الیگونوکلئوتیدی اختصاصی آلل در انتهای 5′ و یک پرایمر معمولی در انتهای 3′ می باشد. در صورتی که پرایمر طراحی شده برای آلل جهش یافته تکثیر شود و باند حاصل از آن بر روی ژل الکتروفورز نمایش یابد، نشان می دهد که توالی هدف حاوی آلل جهش یافته است. به طور مشابه، اگر پرایمر طراحی شده برای آلل جهش یافته تکثیر پیدا نکند، نشان دهنده وجود توالی DNA طبیعی در آن نقطه خاص می باشد.

پرایمرهای مورد استفاده در تکنیک ARMS-PCR

در تکنیک ARMS-PCR از یک جفت پرایمر استفاده می شود که شامل پرایمر Forward و Reverse می باشد. دو پرایمر Forward مختلف برای دو آلل جهش یافته (Mutant) و طبیعی (Wild Type) طراحی می شوند به طوری که باز انتهای 3′ آنها مکمل نوکلئوتید های مد نظر خواهد بود. در بحث طراحی پرایمر، مکمل بودن و جفت شدن نوکلئوتید انتهای 3′ در پرایمر ها از اهمیت بالایی برخوردار است. اگر این باز نتواند با باز مکمل خود جفت شود، تکثیر قطعه انجام نخواهد شد و باندی پس از انجام ژل الکتروفورز مشاهده نمی گردد. پرایمر Reverse مکمل توالی آلل بوده و ثابت می باشد. به همین دلیل این تکنیک در حال حاضر در بحث تشخیص جهش های نقطه ای یا SNP ها مورد استفاده قرار می گیرد.

تعداد سیکل های این تکنیک کمتر از PCR متداول بوده و حدود 20 تا 22 چرخه می باشد. با توجه به اینکه تکنیک ARMS-PCR بیشتر برای شناسایی یک جهش یا یک پلی مورفیسم مورد استفاده قرار می گیرد، تشخیص هموزیگوت یا هتروزیگوت بودن یک آلل با استفاده از پرایمر ها از اهمیت بالایی برخوردار خواهد بود. در برخی موارد پرایمر های طبیعی و جهش یافته در میکروتیوپ های مختلف قرار داده شده و واکنش PCR آنها مجزا انجام می گردد. اما در صورتی که پرایمر های طبیعی و جهش یافته با استفاده از رنگ های فلورسنت نشان دار شوند، نیازی به تفکیک واکنش ها نخواهد بود.

یکی از انواع متداول تکنیک ARMS-PCR، روش Tetra ARMS-PCR است که تعداد پرایمر های مورد استفاده در آن متفاوت می باشد. در این تکنیک تکثیر آلل هدف با کمک 4 عدد پرایمر که شامل 2 پرایمر داخلی (inner primers) و 2 پرایمر خارجی (outer primers) است، انجام خواهد شد. پرایمرهای بیرونی عملکردی مشابه با پرایمر در PCR معمولی دارند و در تکثیر توالی DNA هدف نقش خود را ایفا می کنند. از سوی دیگر، پرایمر داخلی به منظور تشخیص تغییرات آللی از جمله وجود SNP استفاده می گردد. واکنش ARMS PCR Tetr در یک لوله و در یک مرحله PCR اجرا می ‌شود و تغییرات ژنوتیپ از SNP‌ های هدف را می‌توان مستقیماً با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز معمولی مشاهده کرد.

مزایای تکنیک ARMS-PCR

• تشخیص SNPs های مختلف مرتبط با بیماری ها
• معتبر ترین روش در زمینه تشخیص بیماری تالاسمی و کم خونی داسی شکل
• مدت زمان کوتاه انجام واکنش
• عدم نیاز به استفاده از آنزیم های محدود الاثر (Restriction enzymes) در تشخیص پلی مورفیسم ها
• تعیین هتروزیگوت یا هموزیگوت بودن فرد در یک لوکوس ژنی
• شناسایی موتاسیون های JAK2 و HIV

محدودیت های تکنیک ARMS-PCR

• محدودیت در تشخیص ناهنجاری های کروموزومی
• عدم تشخیص حذف ها و مضاعف شدگی ها

منابع علمی

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9558987

https://journal.waocp.org/article_32475_b4309ff77054c351a1f76c13d7bbb04b.pdf

https://bmcresnotes.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13104-018-3236-6