حیطه کاربرد
محصول Trita® EGFR Mutation Assay Kitجهت شناسایی جهش های رایج اگزون ۱۸، ۱۹، ۲۰ و ۲۱ در ژن EGFR طراحی و تولید شده است. این محصول قادر به تعیین نوع جهش ها در اگزون های نام برده نمی باشد و صرفا مشخص می نماید که در کدام اگزون جهش وجود دارد. لیست جهش های مورد بررسی در این محصول به شرح زیر می باشد. اساس عملکرد این محصول، روش مولکولی Fluorescent PCR Multiplex با استفاده از پرایمرهای نشاندار شده میباشد و با استفاده از DNA استخراج شده از بافت سرطانی تازه و یا فیکس شده در فرمالین (FFPE) شناسایی جهش عامل بیماری را مقدور می سازد. این محصول به عنوان یک محصول تشخیص آزمایشگاهی (IVD) در آزمایشگاههای تشخیص ژنتیک کاربرد دارد.
| جهش های مورد بررسی توسط Trita® EGFR Mutation Assay Kit | |
| G719A (2156G>C)
G719C (2155G>T) G719S (2155G>A) |
اگزون ۱۸ |
| E746_A750del (2235_2249del15)
E746_A750del (2236_2250del15) L747_P753>S (2240_2257del18) L747_A750>P (2239_2248TTAAGAGAAG>C) E746_S752>V (2237_2255>T) L747_T751del (2240_2254del15) L747_S752del (2239_2256del18) E746_T751>A (2237_2251del15) L747_T751del (2239_2253del15) L747_T751>P (2239_2251>C) L747_E749del (2239_2247del9) E746_E749del (2235_2246del12) L747_P753>Q (2239_2258>CA) L747_T751>S (2240_2251del12) E746_S752>A (2237_2254del18) L747_A750>P (2238_2248>GC) E746_S752>D (2238_2255del18) E746_T751>I (2235_2252>AAT) L747_T751>Q (2238_2252>GCA) E746_T751del (2236_2253del18) |
اگزون ۱۹ |
| T790M (2369C>T)
S768I (2303G>T) V769_D770insASV (2307_2308insGCCAGCGTG) D770_N771insG (2310_2311insGGT) H773_V774insH (2319_2320insCAC) |
اگزون ۲۰ |
| L858R (2573T>G)
L861Q (2582T>A) |
اگزون ۲۱ |
اساس عملکرد محصول
محصول Trita® EGFR Mutation Assay Kitجهت شناسایی جهشهای رایج اگزون های ۱۸، ۱۹، ۲۰ و ۲۱ در ژن EGFR طراحی و تولید شده است. این محصول قادر به تعیین نوع جهش ها در اگزون های نام برده نمی باشد و صرفا مشخص مینماید که در کدام اگزون جهش وجود دارد.
نمونه بیولوژیک مورد نیاز جهت استفاده از این کیت، بافت سرطانی تازه و یا فیکس شده در فرمالین (FFPE) میباشد. اساس عملکرد این محصول، روش مولکولی Fluorescent PCR Multiplex با استفاده از پرایمرهای نشاندار شده میباشد. این روش از نظر زمان، کارایی و هزینه بسیار مناسب، سریع و مقرون به صرفه است. همچنین، در این کیت، انتخاب نواحی ژنی و طراحی پرایمرها به صورت کاملا اختصاصی و با توجه به عدم وجود پلیمورفیسم در ناحیه اتصال پرایمرها روی ژنوم انجام گرفته است.
| Dye Color | Mutation |
No. |
| Blue | Exone 18 of EGFR gene | 1 |
| Blue | Exone 19 of EGFR gene | 2 |
| Blue | Exone 20 of EGFR gene | 3 |
| Blue | Exone 21 of EGFR gene | 4 |
در محصول Trita® EGFR Mutation Assay Kitمجموعاً ۶ ناحیه (اگزون ۱۸، اگزون ۱۹، اگزون ۲۰ و اگزون ۲۱ و دو ناحیه کنترل) مورد بررسی قرار میگیرند و پرایمرهای این محصول با رنگ فلورسنت F6-FAMTM نشاندار شدهاند. محصول Trita® EGFR Mutation Assay Kit تمامی جهشهای ذکر شده در فوق را در یک واکنش PCR تکثیر نموده و سپس محصول در یک ران Capillary electrophoresis در دستگاه ژنتیک آنالایزر قابل خوانش و شناسایی میباشد. آنالیز و تفسیر نتایج نهایی با نرم افزار ®GeneMarker بر اساس پنل کیت انجام میگیرد. به طور کلی، اساس عملکرد این محصول در تشخیص جهش موجود در ژن EGFR شامل 3 مرحله اصلی زیر میباشد که هر مرحله به شرح زیر صحه گذاری شده است که عبارتند از:
-
استخراج DNA از نمونه بیولوژیک
این محصول با نمونههای بافت سرطانی تازه و یا فیکس شده در فرمالین (FFPE) افراد مبتلا به سرطان، صحهگذاری شده است. همچنین، این محصول با کیت های استخراج DNA از بافت مانند کیتهای QIAamp DNA FFPE Tissue Kit محصول شرکت Qiagen آلمان و TritEx® FFPE Tissue RNA/DNA Extraction Kit محصول شرکت تریتاژن بهینه سازی شده است.
-
واکنش مولکولی Fluorescent PCR Multiplex بر اساس پرایمرهای نشان دار شده که شامل مراحل زیر است:
- دناتوراسیون (Denaturation)
- هیبریداسیون پرایمرها (Primer Hybridization)
- تکثیر مارکرهای ژنی موردنظر به روش PCR (PCR Amplification)
این محصول با دستگاه ترموسایکلر Applied Biosystem (Veriti) و BioRad (T 100) بهینه سازی شده است.
-
آنالیز قطعات تکثیر شده (Fragment Analysis) که شامل مراحل زیر است:
- جداسازی قطعات تکثیر شده (Fragment Seperation) به روش Capillary Electrophoresis
- آنالیز و تفسیر نتایج (Data Analysis) با استفاده از نرم افزار ®GeneMarker
محصول PCR حاصل از این کیت با دستگاه Genetic AnaLyzer مدلهای(xL) ABI 3130 و ABI 3500 (xL) با کپیلاری در سایزهای 30، 50 یا 80 سانتیمتر سازگار میباشد. همچنین، آنالیز و تفسیر نتایج کپیلاری الکتروفورز با استفاده از نرم افزار ®GeneMarker بر اساس پنل کیت (که توسط شرکت برای کاربران ارسال میشود) امکان پذیر است.
محتویات کیت
محصول Trita® EGFR Mutation Assay Kitدر سه مدل 25، 50 و 100 تستی قابل ارائه است. جدول زیر نشان دهندهی اجزای کیت و مقادیر هر یک از آنها در مدلهای مختلف این محصول میباشد.
| The composition of Trita® EGFR Mutation Assay Kit | ||||
| Tube/Cap Color | Vol. for 100 rxn (µl) | Vol. for 50 rxn (µl) | Vol. for 25 rxn (µl) | Kit Contents |
| Amber/Yellow | 4 × 125 | 2 × 125 | 125 | Mix 1 |
| Clear/Red | 4 × 375 | 2 × 375 | 375 | Mix 2 |
|
* The kit contains a quick Manual inside the package. |
||||
ویژگی های فنی
در جدول زیر، مهم ترین ویژگی های فنی محصول Trita® EGFR Mutation Assay Kit به طور خلاصه ارائه شده است:
| Technical specification Trita® EGFR Mutation Assay Kit | |
| Kit Specifications and characteristics
|
Parameters |
| Multiplex Fluorescent PCR | Methodology |
| Qualitative | Technique |
| Semi-quantitative
|
Type of Analysis |
| Exon 18 of EGFR gene
Exon 19 of EGFR gene Exon 20 of EGFR gene Exon 21 of EGFR gene
|
Target Sequence |
| Hu Fresh-frozen or FFPE human cancer specimens | Validated Specimen |
|
-20 ± 5 °C
|
Storage |
|
6-FAMTM
|
Dye |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Germany)
TritEx® FFPE Tissue RNA/DNA Extraction Kit (Tritagene, Iran) |
Validated Extraction Methods |
| BioRad (T 100), Applied Biosystem (Veriti), GeneAmp PCR System 9700
(Ramping rates: heating 0.8 ˚C/s, cooling 1.6 ˚C/s) |
Validated Thermocyclers |
| Applied Biosystems™ 3130/3130 xL Genetic Analyzer
Applied Biosystems™ 3500/3500 xL Genetic Analyzer |
Validated Genetic analyzer |
| 560 SIZER ORANGE (Devyser-Sweden) GeneScan™ 500 LIZ® Size Standard (Life Technologies-USA) GeneScan™ 600 LIZ® Size Standard (Life Technologies-USA)
|
Size standard
|
|
GeneMarker®
|
Validated Software |
