حیطه کاربرد
محصول Trita® Beta Thalassemia PT Diagnostic Kit جهت شناسایی موتاسیون های IVS2-1 (G>C)، IVS1-110 (G>A) ،(T>G) IVS1-128، CD39 (C>T)، CD82-83، CD44 (delC)،(C>G) IVS2-745،(C>A) -88، CD36/37 (delT)، IVS1-25Del،(G>C) Punjab، HBS، Fr8/9 (insG)،(G>T) IVS1-1،(G>C) IVS1-5،IVS1-6 (T>C) ، CD30 (G>C)، CD22/24 (delAAGTTGG)، CD8AA (delAA)، CD15 (G>A) و(delCT) CD5 در کلاستر ژنی بتا گلوبین انسانی که منجر به بروز بیماری تالاسمی بتا میشود طراحی و تولید شده است. اساس عملکرد این محصول، روش مولکولی Multiplex Fluorescent ARMS PCR میباشد و با استفاده از DNA تخلیص شده از خون محیطی (Peripheral blood) افراد بالغ یا نوزاد، امکان تشخیص بتا تالاسمی را فراهم میسازد.
اساس عملکرد محصول
محصول Trita® Beta Thalassemia PT Diagnostic Kit به منظور شناسایی موتاسیونهای نقطه ای IVS2-1 (G>C)، IVS1-110 (G>A) ،(T>G) IVS1-128، CD39 (C>T)، CD82-83، CD44 (delC)،(C>G) IVS2-745،(C>A) -88، CD36/37 (delT)، IVS1-25Del،(G>C) Punjab، HBS، Fr8/9 (insG)،(G>T) IVS1-1،(G>C) IVS1-5،IVS1-6 (T>C) ، CD30 (G>C)، CD22/24 (delAAGTTGG)، CD8AA (delAA)، CD15 (G>A) و(delCT) CD5 که منجر به بروز بیماری ژنتیکی تالاسمی بتا میشود، طراحی و تولید شده است. نمونه بیولوژیک مورد نیاز جهت استفاده از این کیت، خون محیطی (Peripheral blood) افراد بالغ یا نوزاد میباشد. اساس عملکرد این محصول، روش مولکولی Multiplex Fluorescent ARMS PCR میباشد. در این محصول، جهت شناسایی هر یک از موتاسیونهای نام برده، پرایمرهای اختصاصی نشاندار طراحی گردیده است. روش عملکرد این کیت از نظر زمان، کارایی و هزینه بسیار مناسب، سریع و مقرون به صرفه است. همچنین، در این کیت، انتخاب نواحی ژنی و طراحی پرایمرها به صورت کاملا اختصاصی و با توجه به عدم وجود پلیمورفیسم در ناحیه اتصال پرایمرها روی ژنوم انجام گرفته است. در محصول Trita® Beta thalassemia PT Diagnostic Kit مجموعاً ۲۱ موتاسیون مورد بررسی قرار میگیرند. پرایمرهای این محصول با رنگ فلورسنت 6-F6-FAMTM، ®VIC و NEDTM نشاندار شدهاند (جدول ۲). در واکنش مولکولی PCR، پرایمرهای فلورسنت به طور اختصاصی نواحی ژنی موردنظر از ژن بتا-گلوبین انسانی را در یک واکنش Multiplex تکثیر نموده و سپس محصول واکنش PCR با یک ران Capillary electrophoresis با دستگاه ژنتیک آنالایزر قابل شناسایی میباشد.
| Dye Color | Mutation |
No. |
| Blue | IVS2-1 | 1 |
| Blue | 1VS1-110 | 2 |
| Blue | IVS1-128 | 3 |
| Blue | CD39 | 4 |
| Blue | CD82-83 | 5 |
| Blue | CD44 | 6 |
| Blue | IVS2-745 | 7 |
| Blue | -88 | 8 |
| Blue | CD36/37 | 9 |
| Blue | IVS1-25Del | 10 |
| Blue | Punjab | 11 |
| Green | HBS | 12 |
| Green | Fr8/9 (+G), CD8-AA | 13 |
| Green | IVS1-1 | 14 |
| Green | IVS1-5 | 15 |
| Yellow | IVS1-6 | 16 |
| Yellow | CD30 | 17 |
| Yellow | CD22/24 | 18 |
| Yellow | CD15 | 19 |
| Yellow | Fr8/9 (+G), CD8-AA | 20 |
| Yellow | CD5 | 21 |
به طور کلی، اساس عملکرد این محصول در تشخیص بیماری تالاسمی بتا شامل 4 مرحله اصلی زیر میباشد که هر مرحله به شرح زیر صحه گذاری شده است که عبارتند از:
-
استخراج DNA از نمونه بیولوژیک
این محصول با نمونههای خون محیطی (Peripheral blood) افراد بالغ یا نوزاد، صحهگذاری شده است. همچنین، این محصول با کیت های استخراج DNA به روش ستونی مانند کیت QIAamp® DNA Blood Mini Kit محصول شرکت Qiagen آلمان سازگار است. علاوه بر این، روشهای استخراج DNA رسوبی نیز کاربردی است.
-
واکنش مولکولی Multiplex Fluorescent ARMS PCR است که شامل مراحل زیر است:
- دناتوراسیون (Denaturation)
- هیبریداسیون پرایمرها (Primer Hybridization)
- تکثیر مارکرهای ژنی موردنظر به روش PCR (PCR Amplification)
این محصول با دستگاه ترموسایکلر Applied Biosystem (Veriti) و BioRad (T 100) بهینه سازی شده است.
-
شناسایی قطعات تکثیر شده (Fragment Separation)
جداسازی قطعات تکثیر شده (Fragment Seperation) به روش Capillary Electrophoresis با دستگاه Genetic AnaLyzer مدلهای(xL) ABI 3130 و ABI 3500 (xL) صحه گذاری شده است که با کپیلاری در سایزهای 30، 50 یا 80 سانتی متر سازگار میباشد.
-
آنالیز قطعات تکثیر شده (Fragment Analysis)
آنالیز و تفسیر نتایج (Data Analysis) با استفاده از نرم افزار ®GeneMarker بر اساس پنل کیت تالاسمی بتا (که توسط شرکت برای کاربران ارسال میشود) امکان پذیر است.
محتویات کیت
محصول Trita® Beta Thalassemia PT Diagnostic Kit در سه مدل 25، 50 و 100 تستی قابل ارائه است. جدول زیر نشان دهندهی اجزای کیت و مقادیر هر یک از آنها در مدلهای مختلف این محصول میباشد.
| The composition of Trita® Beta Thalassemia PT Diagnostic Kit | ||||
| Tube/Cap Color | Vol. for 100 rxn (µl) | Vol. for 50 rxn (µl) | Vol. for 25 rxn (µl) | Kit Contents |
| Amber/Yellow | 4 × 75 | 2 × 75 | 75 | SOLβ-1 |
| Amber/Green | 4 × 75 | 2 × 75 | 75 | SOLβ-2 |
| Clear/Clear | 4 × 100 | 2 × 100 | 100 | SOLβ-3 |
| Clear/Clear | 4 × 750 | 2 × 750 | 750 | SOLβ-4 |
|
* The kit contains a user’s Manual inside the package. |
||||
ویژگی های فنی
در جدول زیر، مهم ترین ویژگی های فنی محصول Trita® Beta Thalassemia PT Diagnostic Kit به طور خلاصه ارائه شده است:
| Technical specification of Trita® Beta Thalassemia PT Diagnostic Kit | |
| Parameters | Kit Specifications and characteristics |
| Technique | Multiplex Fluorescent ARMS PCR |
| Detection Method | Capillary electrophoresis |
| Type of Analysis | Qualitative |
| Target Sequence | Detection of β-thalassemia-associated
Point mutation: IVS1-110, IVS1-128, CD39, CD82-83, CD44, IVS2-745, -88, CD36/37, IVS1-25Del, Punjab, HBS, Fr8/9, IVS1-1, IVS1-5, IVS1-6, CD30, CD22/24, CD8AA, CD15 & CD5
|
| Validated Specimen | DNA extracted from peripheral blood (adults & newborns) |
| Specificity | More than %99 |
| Sensitivity | More than %99 |
| Storage |
-20 ± 5 °C |
| Dye |
6-FAMTM VIC® NEDTM |
| Validated
Extraction Methods |
QIAamp® DSP DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Germany) |
| Validated thermocyclers | BioRad (T 100), Applied Biosystem (Veriti)
(Ramping rates: heating 0.8 ˚C/s, cooling 1.6 ˚C/s) |
| Validated
Genetic AnaLyzers |
Applied Biosystems™ 3130/3130 xL Genetic AnaLyzer
Applied Biosystems™ 3500/3500 xL Genetic AnaLyzer |
| Size standard | 560 SIZER ORANGE (Devyser-Sweden)
GeneScan™ 500 LIZ® Size Standard (Life Technologies-USA) GeneScan™ 600 LIZ® Size Standard (Life Technologies-USA) |
| Validated Softwares |
GeneMarker® |
