KRAS

ژن KRAS و اهمیت آن در بروز بیماری ها

یکی از شناخته شده ترین انکوژن با بالاترین میزان جهش در بین همه سرطان ها ژن KRAS (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homologue) می باشد که جهش در آن مرتبط با بروز انواعی از سرطان های بسیار کشنده از جمله آدنوکارسینوم مجرای پانکراس (pancreatic ductal adenocarcinoma) یا به اختصار PDAC، سرطان ریه سلول غیر کوچک (nonsmall-cell lung cancer) یا به اختصار NSCLC و همچنین سرطان کولورکتال (colorectal cancer) است. شناسایی ژن‌ های محرک تومور (tumour driver genes) و افزایش سطح برخی مهارکننده ‌های خاص، از جمله استراتژی‌ های درمان سرطان است که نتایج بالینی مثبتی را ایجاد کرده است. نتایج بالینی متعدد نشان داده اند که درمان های هدفمند (targeted therapies) به طور قابل توجهی بقا را افزایش داده و سمیت کمتری نسبت به شیمی درمانی استاندارد خواهند داشت. به عنوان مثال، درمان های هدفمند در بیمارانی که دارای جهش حساس به گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی (epidermal growth factor receptor) یا به اختصار EGFR و ادغام ژن لنفوم کیناز آناپلاستیک (anaplastic lymphoma kinase) یا به اختصار ALK هستند، زمان بقا به طور قابل توجهی افزایش می یابد.

در حال حاظر با وجود پیشرفت ها دارویی اما هنوز مکانیسمی جهت هدف قرار دادن ژن KRAS گزارش نشده است. البته باید توجه داشت که داروی sotorasib اخیرا به منظور هدف قرار دادن زیر نوع های KRAS جهش یافته (mutated KRAS subtype) G12C تائید شده است. به طور کلی، در بحث درمان بیماری های مرتبط با جهش در ژن KRAS رویکرد هایی که وجود دارد شامل هدف قرار دادن غیر مستقیم KRAS است از جمله این موارد می توان به هدف‌ گیری افکتور های سیگنالینگ پایین ‌دستی آن، رویکرد های اپی ژنتیکی مانند مهارکننده ‌های تلومراز و RNA interference اشاره کرد. از سوی دیگر، برخی رویکرد های کشندگی مصنوعی (synthetic lethality approaches) مانند مهارکننده‌های کیناز وابسته به سیکلین (synthetic lethality approaches) نیز مورد استفاده قرار می گیرند که ممکن است موثر باشند.

ساختار و عملکرد مولکولی KRAS

ژن KRAS عضوی از خانواده انکوژن ویروسی سارکوم موش صحرایی (rat sarcoma viral oncogene family) یا به اختصار RAS است که دارای دو ایزوفرم دیگر در انسان می باشد: انکوژن‌ های ویروسی Harvey (HRAS) و نوروبلاستوما سارکوم موش صحرایی (NRAS). در سال 1982، Weinberg و Barbacid ژنی را از رده های سلولی سرطان مثانه انسان جدا کردند. متعاقبا، این ژن به عنوان همولوگ انسانی ژن RAS، به نام HRAS، در بازوی کوتاه کروموزوم 11 (11p15.1–11p15.3) شناسایی شد. در همان سال، همولوگ دیگری در سلول های سرطان ریه انسان به نام KRAS یافت شد که روی بازوی کوتاه کروموزوم 12 قرار داشت (12p11.1–12p12.1). آخرین ژن به نام NRAS در نوروبلاستوم انسان مشخص گردید که موقعیت آن روی بازوی کوتاه کروموزوم 1 (1p22–1p32) می باشد. ژن‌ های RAS از نظر تکاملی دارای ساختاری حفاظت شده است و به طور کلی متشکل از چهار اگزون می باشد.

ژن KRAS یک پروتئین متصل شونده به GTP/GDP را کد می کند که به خانواده گوانوزین تری فسفاتاز (GTPase) RAS تعلق دارد. این مولکول در حقیقت نوعی سویچ است که با تبدیل GTP و GDP به یکدیگر، انتقال سیگنال ها را از گیرنده های غشایی فعال شده به مولکول های درون سلولی را کنترل می کند. این سویچ کردن عمدتا توسط دو پروتئین GEFs (guanine nucleotide exchange factors) مانند SOS و GAPs (GTPase-activating proteins) مانند NF1 تنظیم می گردد. KRAS در حالت غیر فعال به GDP متصل است اما هنگامی که سلول ‌ها محرک ‌های مربوطه مانند برهمکنش EGF و EGFR را دریافت می ‌کنند، GDP با GTP در ساختار کمپلکس جایگزین می گردد.

این ژن با استفاده از پیرایش متفاوت اگزون 4 ، دو splice variants متناوب به نام های KRAS 4A و KRAS 4B را ایجاد می کند که در میان آنها، KRAS 4B به دلیل بیان گسترده و بالا در سرطان های انسانی مدت ها به عنوان ایزوفرم اصلی در نظر گرفته شده است. البته باید توجه داشت که بیان بالای KRAS 4A نیز در سرطان های مختلفی مشاهده شده و احتمالا می‌ تواند سازگاری سلول ‌های تومور را تحت استرس افزایش دهد. پروتئین KRAS دارای وزن مولکولی 21 کیلو دالتون است و از شش رشته بتا (beta strands) و پنج مارپیچ آلفا (five alpha helices) تشکیل شده است که دارای دو دومین (domain) اصلی به نام های G-domain و C-terminal می باشد.

G-domain بسیار حفاظت شده است و شامل لوپ های switch I و switch II می باشد که مسئول تبادل GDP-GTP هستند. از سوی دیگر، C-terminal یک ناحیه بسیار متغییر (hypervariable region) یا به اختصار HRV، شامل موتیف CAAX (c=cysteine, A = any aliphatic amino acid, X = any amino acid) است که یک توالی هدف برای تغییرات مختلف پس از ترجمه است. دومین C-terminal نقش مهمی در سنتز و پردازش KRAS trafficking و لنگر انداختن در غشای پلاسمایی (plasma membrane anchoring) ایفا می کند.

مسیر سیگنالینگ KRAS

به طور کلی، پروتئین های KRAS انواعی از سوئیچ های مولکولی با دقت بسیار بالا هستند که آبشارهای سیگنالینگ متعددی را از طریق چرخش بین حالت ‌های فعال و غیرفعال کنترل می ‌کنند. این پروتئین ها می توانند توسط فاکتورهای رشد، کموکاین ها، یون کلسیم یا گیرنده تیروزین کیناز (RTK) فعال شوند. پروتئین KRAS فعال قادر است مسیرهای سیگنال دهی متعددی از جمله RAF (rapidly accelerated fibrosarcoma)، MEK (mitogen-activated protein kinase)، ERK (extracellular regulated protein kinases)، PI3K (phosphoinositide 3-kinase) ، mTOR و چندین مسیر دیگر را فعال نماید.

زمانی که KRAS به GTP متصل می شود، فعال شده و مسیر های سیگنالینگ پائین دست خود را سیگنال دهی می کند. این مسیرها عملکرد های متعددی را در سلول از جمله تکثیر سلولی، آپوپتوز، تحرک سلولی و بقا کنترل می کنند. فعال سازی KRAS از طریق اتصال چندین فاکتور رشد به گیرنده های آنها، از جمله گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی (EGFR) که بیشترین ارتباط را در سرطان ریه دارد، رخ می دهد. EGF یکی از فعال کننده های KRAS می باشد. از سوی دیگر، پروتئین های آداپتور همراه با دومین درون سلولی EGFR عمل کرده و فاکتورهایی مانند SOS را جذب می کنند. سپس با RAS ترکیب می شوند تا تبدیل GDP به GTP را تسهیل بخشند.

RAS دارای یک فعالیت GTPase ذاتی از طریق برهمکنش با پروتئین های فعال کننده GTPase است که باعث هیدرولیز GTP به GDP شده و در نهایت سیگنال RAS خاتمه می یابد. جهش در مولکول های RAS این فعالیت ذاتی GTPase را مختل می کند، بنابراین آن را در یک ترکیب GTP فعال، مستقل از سیگنال بالادستی قفل می کند و مسیر سیگنال دهی بدون توقف فعال خواهد بود.

جهش در ژن KRAS و بروز سرطان

متداول ترین عضو جهش یافته از خانواده RAS، ژن KRAS می باشد که به عنوان یکی از مهم ترین آنکوژن ها در سرطان های انسانی در نظر گرفته می شود. این جهش ها در سرطان کلورکتال (CRC)، PDAC و NSCLC از جمله شایع ترین موتاسیون ها هستند. اغلب این جهش ها به صورت single-base missense هستند که در 98% موارد در کدون 12 (G12)، کدون 13 (G134) و کدون 61 (G61) رخ می دهند. باید توجه داشت که جهش در ژن KRAS با فرکانس های متفاوتی در انواع سرطان ها رخ می دهد، علاوه بر این نوع جهش ها نیز متفا.ت می باشد. به عنوان مثال در NSCLC جهش در KRAS در 4/20% موارد رخ می دهد و نوع موتاسیون غالب آن G12C (گلیسین (GGT) به سیستئین (TGT)) می باشد. در حالی که جهش KRAS تا 6/67 درصد از KRAS در آدنوکارسینوم پانکراس را در بر گرفته و G12D نوع جهش غالب آن می باشد.

پروفایل های جهش های KRAS در افراد سیگاری و غیرسیگاری متمایز است و همه جهش ها در KRAS از نوع موتاسیون های محرک نیستند. بروز جهش های KRAS بین 25 تا 35 درصد در افراد سیگاری و 5 درصد در غیرسیگاری ها گزارش شده است و معمولاً سیگار به عنوان یک عامل مرتبط در نظر گرفته می شود. به عنوان مثال، KRAS (G12C) معمولاً در بیمارانی که به شدت سیگار می‌ کشند، یافت می گردد، در حالی که KRAS (G12D) معمولاً در تومورهای بیماران غیرسیگاری شناسایی شده است.

تشخیص جهش های ژن KRAS

به طور کلی، بروز جهش در ژن KRAS از جمله شایع ترین موتاسیون ها در اغلب آنکوژن هاست. به همین علت، اولین روش و متداول ترین تکنیک جهت شناسایی جهش های KRAS، PCR و سایر تکنیک های مبتنی بر PCR مانند real-time PCR ، RFLP، ARMS و allele-specific PCR می باشد. امروزه استفاده از روش های توالی یابی مختلف مانند سانگر و NGS از پیشرفته ترین روش های تشخیص KRAS به شمار می روند. توالی یابی سانگر بر اساس سنتز DNA مکمل توسط DNA پلیمراز با استفاده از دو مجموعه مختلف از اسیدهای نوکلئیک (dNTP و ddNTP) است.

استفاده از یک ddNTP در حین سنتز رشته منجر به خاتمه واکنش می شود. با نسبت بهینه dNTPs به ddNTPs، مجموعه ای از قطعات با طول های متفاوتی تولید می شوند که هر کدام دارای واحدهای مونوفسفات نوکلئوزیدی متفاوتی هستند. با برچسب گذاری (tagging) هر یک از ddNTP ها با 4 فلوروفور مختلف، توالی DNA را می توان با تجزیه و تحلیل انتشار فلورسنت در حین عبور قطعات از یک سیستم تشخیص لیزری خواند. روش توالی یابی سانگر می تواند تا 800 نوکلئوتید را به صورت همزمان توالی یابی کند که برای آنالیزهای KRAS کافی است. در جدول زیر انواع روش های مورد استفاده در شناسایی جهش های KRAS ذکر شده است.

Main disadvantages	Main advantages	Turnaround time	Sensitivity (mutant/wild-type) (%)	Method
Insensitive, time consuming, open PCR system is easily contaminated	Detects all possible mutations, cost-effective	Slow (4 d to 2 wk)	20–30	Sanger sequencing
Occasionally difﬁcult to distinguish between mutation types	Rapid, closed PCR system, detects all possible mutations (heterozygous and homozygous)	Rapid	5	Real-time PCR with HRMA
Detects only the 7 most common mutations, requires more tissue for analysis compared with other methods	Rapid, closed PCR system	Rapid	10	Allele-speciﬁc real-time PCR
Requires conﬁrmation by sequencing, complicated	Sensitive	Slow	0.1	RFLP with sequencing

درمان بیماری های مرتبط با جهش KRAS

میل ترکیبی بالای RAS به GTP/GDP و غلظت های درون سلولی بالای آن، از اصلی ترین دلایل شکست روش های درمانی با استفاده از مهارکننده های رقابتی در بیماری هایی که دارای جهش در ژن KRAS هستند، بوده است. از این رو، تلاش ‌ها در گذشته عمدتاً بر هدف‌ گیری غیر مستقیم KRAS یا با استفاده از شیمی ‌درمانی سیتوتوکسیک معمولی یا مهار سایر عوامل پایین‌دستی، متکی می باشد. از جمله داروهایی که تا امروز تائیدیه دریافت کرده اند می توان به Sotorasib و Adagrasib اشاره نمود. Sotorasib نوعی داروی خوراکی است که مهارکننده KRAS G12C بوده به طور دائم KRAS G12C را در حالت غیرفعال GDP-complex مسدود می کند. Adagrasib نیز مهارکننده کوالانسی G12C است که از طریق اتصال به cryptic pocket در GDP-KRAS منجر به بلاک مسیر سیگنالینگ KRAS می گردد.